Erzeugung eines Blut-Hirn-Schranken-Chips unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten Vorläuferzellen

Man nehme einen mikrofluidischen Chip mit überlagerten, matrixbeschichteten Kanälen, die durch eine poröse Membran getrennt sind.

Seet iPSC-abgeleitete neurale Vorläuferzellen im oberen Kanal. Inkubieren Sie, um die Zelladhärenz zu gewährleisten, und waschen Sie sie dann, um die nicht gebundenen Zellen zu entfernen.

Als nächstes säen Sie iPSC-abgeleitete mikrovaskuläre Endothelzellen des Gehirns im unteren Kanal.

Invertieren Sie den Chip und inkubieren Sie ihn, um die Endothelzellen an der Membranseite des unteren Kanals zu befestigen.

Drehen Sie als Nächstes den Chip um, um Zellen an der unteren Seite des Kanals zu befestigen und eine einschichtige röhrenartige Struktur zu bilden. Waschen Sie beide Kanäle mit zellspezifischen Medien.

Kontinuierlich fließt ein neuronales Differenzierungsmedium im oberen Kanal und ein Endothelzellmedium im unteren Kanal.

Endothelzellen nutzen Wachstumsfaktoren vom Medium bis zur Reife und bilden Tight Junctions, die einem Blutgefäß ähneln und die Blutseite bilden.

Neurotrophe Faktoren treiben die Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen in verschiedene Gehirnzellen voran, die die Gehirnseite bilden. Diese Zellen interagieren mit den Endothelzellen und bilden so eine Blut-Hirn-Schranke auf dem Chip.

Bringen Sie zunächst das Gericht mit den vorbereiteten Chips in die Biosicherheitswerkbank. Waschen Sie beide Kanäle vorsichtig mit einer P200-Pipette, indem Sie 200 Mikroliter neuronales Differenzierungsmedium in den Einlass geben und die Flüssigkeit aus dem Auslass ziehen. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen und saugen Sie überschüssige Medientröpfchen vorsichtig von der Oberfläche des Chips ab.

Bewegen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Um die von iPSC abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen in den oberen Kanal zu säen, um die Gehirnseite zu erzeugen, fügen Sie eine P200-Spitze mit 30 bis 100 Mikrolitern Zellsuspension in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen pro Milliliter in den oberen Kanaleinlass hinzu und lösen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette.

Nehmen Sie eine leere P200-Pipette, um den Kolben zu drücken, führen Sie ihn in den oberen Kanalauslass ein und ziehen Sie die einzellige Suspension vorsichtig durch die Spitze. Übertragen Sie den Chip auf das Mikroskop, um die Aussaatdichte bei homogener Verteilung der Zellen im oberen Kanal zu überprüfen. Nachdem Sie die Zelldichte bei 20 % Bedeckung bestätigt haben, legen Sie die Chips sofort für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in den Inkubator.

Waschen Sie danach die Zellen, die sich nicht anheften, weg, indem Sie frisches neuronales Differenzierungsmedium in den Einlass geben und die Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Auslass sammeln. Halten Sie die Zellen unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius mit einem täglichen Austausch des neuronalen Differenzierungsmediums. Nach dem Anheften der iNPCs oder am folgenden Tag nach der Aussaat bringen Sie die Schale mit den vorbereiteten Chips in die Biosicherheitswerkbank. Waschen Sie den unteren Kanal vorsichtig mit 200 Mikrolitern Endothelzellmedium.

Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie vorsichtig Tröpfchen mit überschüssigem Endothelzellmedium von der Oberfläche des Chips ab und achten Sie darauf, dass das Medium in beiden Kanälen verbleibt. Bewegen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Unter Verwendung einer P200-Pipette werden 30 bis 100 Mikroliter der aus iPSC gewonnenen mikrovaskulären Endothelzellsuspension des Gehirns in einer Konzentration von 14 bis 20 x 10⁶ Zellen pro Milliliter entnommen und die Spitze in den unteren Kanaleinlass eingeführt.

Der wichtigste Schritt, um funktionelle Barriereeigenschaften zu erreichen, ist die Aussaat von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns. Es ist entscheidend, Zellen mit der richtigen Dichte zu säen, um Blasenbildung zu vermeiden und eine homogene Verteilung innerhalb der Organscheide zu gewährleisten.

Drücken Sie den Kolben einer P200-Pipette mit leerer Spitze, führen Sie ihn in den Auslass des unteren Kanals ein und lassen Sie den Pipettenkolben langsam los, um die einzellige Suspension vorsichtig durch den unteren Kanal zu ziehen. Die überschüssige Zellsuspension wird von der Oberfläche des Chips abgesaugt. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit den Einlass- und Auslassöffnungen, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus den Kanälen abgesaugt wird. Übertragen Sie den Chip auf das Mikroskop, um die Aussaatdichte zu überprüfen.

Der untere Kanal ist mit Zellen gefüllt, zwischen denen keine Lücken zu erkennen sind. Nachdem Sie die korrekte Zelldichte bestätigt haben, säen Sie die Zellen in die restlichen Chips. Um die Zellen an der porösen Membran zu befestigen, die sich oben auf dem unteren Kanal befindet, drehen Sie jeden Chip um und lassen Sie sie in einer Chiphalterung ruhen. Platzieren Sie ein kleines Reservoir mit sterilem DPBS in der 150-Millimeter-Schale, um die Zellen mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Inkubieren Sie die Chips bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden oder bis sich die Zellen im unteren Kanal angelagert haben. Sobald sich die iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns angelagert haben, drehen Sie die Chips wieder in eine aufrechte Position, um die Zellanhaftung am unteren Teil des unteren Kanals zu ermöglichen. 48 Stunden nach der Aussaat der aus iPSC gewonnenen mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns wird die Temperatur des Endothelzellmediums ausgeglichen, indem Sie sich eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad erwärmen.

Anschließend wird das Medium 15 Minuten lang durch Inkubation unter einem vakuumbetriebenen Filtrationssystem entgast. Desinfizieren Sie anschließend die Außenseite der Verpackung und der Schalen des tragbaren Moduls mit 70 % Ethanol, wischen Sie sie ab und geben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Öffnen Sie die Verpackung, und legen Sie die Module in das Fach ein. Richten Sie sie mit den Behältern nach hinten in das Tablett aus. Pipettieren Sie 3 Milliliter des voräquilibrierten warmen Mediums in jedes Einlassreservoir. Geben Sie das Endothelzellkulturmedium in das Einlassreservoir des unteren Kanals und das neuronale Differenzierungsmedium in das Einlassreservoir des oberen Kanals des oberen Kanals.

Pipettieren Sie dann 300 Mikroliter des voräquilibrierten warmen Mediums in jedes Auslassreservoir direkt über jedem Auslassanschluss. Platzieren Sie bis zu 6 tragbare Module auf jedem Fach. Bringen Sie die Tabletts in den Inkubator und schieben Sie sie vollständig in das Kulturmodul, wobei der Tablettgriff nach außen zeigt. Wählen Sie den Primzyklus aus, und führen Sie ihn auf dem Kulturmodul aus. Schließen Sie die Inkubatortür und lassen Sie das Kulturmodul die tragbaren Module etwa eine Minute lang vorbereiten.

Der Ansaugzyklus ist abgeschlossen, wenn in der Statusleiste "Bereit" angezeigt wird. Nehmen Sie das Tablett aus dem Kulturmodul und bringen Sie es in die Biosicherheitswerkbank. Überprüfen Sie die Unterseite jedes tragbaren Moduls in der Biosicherheitswerkbank, um sicherzustellen, dass die tragbaren Module erfolgreich vorbereitet wurden. Achten Sie auf das Vorhandensein kleiner Tröpfchen an allen vier Anschlüssen. Wenn ein tragbares Modul keine Tröpfchen anzeigt, führen Sie den Prime-Zyklus auf diesen Modulen erneut aus. Wenn Medien auf das Fach getropft sind, was häufiger an den Auslassöffnungen geschieht, reinigen Sie das Fach mit 70 % Ethanol.

Waschen Sie anschließend beide Kanäle jedes Chips vorsichtig mit warmem, äquilibriertem zellspezifischem Kulturmedium, um mögliche Blasen im Kanal zu entfernen, und platzieren Sie kleine Medientröpfchen auf der Oberseite jedes Einlass- und Auslassanschlusses. Setzen Sie die Chips mit Trägern in die tragbaren Module ein und platzieren Sie bis zu sechs Chips auf jedem Fach. Setzen Sie die Tabletts in das Kulturmodul ein. Programmieren Sie die entsprechenden Kulturbedingungen für Organchips, wie z. B. Flussrate und Dehnung auf dem Kulturmodul. Sobald der Regulationszyklus abgeschlossen ist, was etwa zwei Stunden dauert, beginnen die programmierten Bedingungen. Danach beginnt das Kulturmodul mit dem Fluss unter den voreingestellten Organ-Chip-Kulturbedingungen.