Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Nehmen Sie Bodengewebe des Mittelhirns, das aus der ventralen Region des Mittelhirns von Mausembryonen isoliert wurde.

Das Gewebe ist reich an sich entwickelnden Dopamin-Neuronen, die den Neurotransmitter Dopamin freisetzen.

Fügen Sie eine Enzymlösung hinzu, um die Gewebematrix aufzubrechen und dadurch die Zellen zu lockern.

Fügen Sie eine Serumlösung hinzu, die DNase I enthält, und dissoziieren Sie das verdaute Gewebe mechanisch, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Die Serumproteine hemmen die Enzyme, während DNase I die bei der Zelllyse freigesetzte extrazelluläre DNA abbaut und so die Zellverklumpung verhindert.

Lassen Sie die Gewebetrümmer absetzen und übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein frisches Röhrchen.

Zentrifugen und entfernen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Dopamin-Neuronenmedium (DPM).

Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte, die mit einem Zellkultursubstrat in der Mitte der Vertiefungen beschichtet ist, wodurch Mikroinseln entstehen.

Bringen Sie die Zellen in die Mitte der Mikroinseln, um sie in hoher Dichte zu kultivieren.

Inkubieren, damit die Zellen an den Mikroinseln haften können.

Füllen Sie die Vertiefungen mit DPM und inkubieren Sie, um das Wachstum von Dopamin-Neuronen zu erleichtern.

Um primäre embryonale Mittelhirnkulturen aus Mausembryonen am Tag 13,5 von Mäusen zu erhalten, geben Sie alle entnommenen Mittelhirnböden in dasselbe 1,5-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Proben dreimal mit 500 Mikrolitern kalzium- und magnesiumfreiem HBSS pro Waschgang. Ersetzen Sie nach der letzten Wäsche das HBSS durch 0,5 % Trypsin für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation geben Sie 500 Mikroliter einer frisch zubereiteten DNase I in FBS-Lösung in das teilweise verdaute Gewebe und verwenden Sie eine silikonisierte Glaspipette mit feuerpolierter Spitze, um das Gewebe zu zerreiben. Wenn nur winzige, kaum sichtbare Partikel zu sehen sind, lassen Sie diese Gewebefragmente am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens absetzen und überführen Sie den Überstand in ein leeres konisches 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen.

Geben Sie einen Milliliter HBSS in das Röhrchen, das DNase I in FBS enthält, und mischen Sie es mehrmals durch Pipettieren. Übertragen Sie einen Milliliter dieser Lösung auf die restlichen Gewebepartikel und zerkleinern Sie die Proben erneut. Dann wird die verdaute Zellsuspension mit dem Überstandsröhrchen gepoolt, ohne verbleibende Gewebefragmente zu übertragen. Nachdem Sie die Gewebeprobe ein weiteres Mal mit der restlichen DNase I in FBS in HBS verreibt haben, sedimentieren Sie die gesammelten Zellen durch Zentrifugation und aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.

Waschen Sie die Zellen zweimal in zwei Millilitern erwärmtem Dopamin-Neuronenmedium pro Waschgang und resuspendieren Sie die Zellen bei 3 x 10⁴ Zellen pro sechs Mikroliter frischer, warmer Mediumkonzentration in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie anschließend das Medium von jeder zuvor vorbereiteten Mikroinsel und mischen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren, bevor Sie mit einer 10-Mikroliter-Pipette sechs Mikroliter Zellen zu jeder Mikroinsel hinzufügen.

Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, füllen Sie die leeren Vertiefungen an den Rändern der Platte mit 150 Mikrolitern Wasser oder PBS und stellen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator. Geben Sie am Ende der Inkubation 100 Mikroliter frisches Dopamin-Neuronenmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.