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Nehmen Sie einen immobilisierten transfizierten koronalen Mausschnitt in einer Aufnahmekammer, die mit aCSF perfundiert ist.
Die Scheibe enthält eine spärliche pyramidale Neuronenpopulation, die ein Zielenzym und ein fluoreszierendes Protein exprimiert.
Bauen Sie eine Aufzeichnungspipette zusammen, die aus einer intrazellulären Lösung und einer Elektrode besteht, die mit einem Verstärker zur Messung neuronaler Signale verbunden ist.
Identifizieren Sie mikroskopisch den Zielgewebebereich und lokalisieren Sie ein fluoreszierendes Neuron.
Üben Sie positiven Druck auf die Pipette aus, um ein Verstopfen zu verhindern, und schieben Sie sie zum Zielneuron weiter.
Der Überdruck bewirkt bei Kontakt eine leichte Vertiefung auf der neuronalen Membran.
Lassen Sie den Druck ab und bilden Sie eine dichte Abdichtung zwischen der Membran und der Spitze.
Stellen Sie das Haltepotenzial auf einen konstanten negativen Wert ein, um das Neuron zu stabilisieren.
Üben Sie einen kurzen Unterdruck aus, um die Membran zu durchbrechen, das Zytoplasma mit dem Inneren der Pipette zu verbinden und eine Ganzzellkonfiguration herzustellen.
Wechseln Sie in den Stromzangenmodus und legen Sie positive Stromimpulse an, die Aktionspotentiale erzeugen, die auf neuronale Erregbarkeit hinweisen.
Übertragen Sie eine Scheibe mit einer Pasteur-Pipette oder einem kleinen Pinsel in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit einer Harfe nach unten und perfundieren Sie sie mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von 2 Millilitern pro Minute. Um ein GFP-positives Neuron zu patchen, lokalisieren Sie den interessierenden Bereich durch das Mikroskop bei 10x. Finden Sie dann eine GFP-positive Zelle mit dem 60x-Objektiv.
Füllen Sie anschließend die Aufzeichnungselektrode mit intrazellulärer Lösung. Setzen Sie anschließend eine Glaspipette in den Pipettenhalter ein. Legen Sie anschließend die Pipettenspitze in die Badewanne und fokussieren Sie sich auf die Spitze. Sobald sich die Pipette im Bad befindet, üben Sie über das Gegendruckkontrollsystem Überdruck aus.
Nähern Sie sich der interessierenden Zelle unter visueller Führung, während Sie den Gegendruck in der Pipette aufrechterhalten. Wenn ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche erscheint, lassen Sie den Druck ab. An dieser Stelle kann sich eine dichte Abdichtung mit einem Widerstand größer als 1 Gigaohm bilden. Andernfalls üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um dies zu erleichtern.
Während die Dichtung gebildet wird, die Haltespannungsklemme auf minus 60 Millivolt bringen. Sobald die Gigaohm-Versiegelung gebildet ist, wenden Sie einen Saugimpuls an, um die Zellmembran zu durchbrechen und in den Ganzzellenmodus zu übergehen. Sobald es sich im Ganzzellenmodus befindet, wechseln Sie vom Voltage-Clamp- in den Current-Clamp-Modus und starten Sie die Aufnahme.