Ein nicht-invasiver Ansatz zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen

Legen Sie gentechnisch veränderte Zebrafischembryonen unter ein Stereomikroskop und beobachten Sie die spontane Schwanzspirale, die von den Motoneuronen des Rückenmarks ausgelöst wird.

Die intrinsischen Eigenschaften dieser Neuronen bewirken einen Ioneneinstrom durch Natriumkanäle, was zu einer spontanen Membrandepolarisation und der Erzeugung von Aktionspotentialen führt, die sich auf die Muskeln ausbreiten und das Schwanzwickeln auslösen. Messen Sie die Wickelfrequenz.

Übertragen Sie einige Embryonen auf einen Natriumkanalblocker, um den Natriumeinstrom zu hemmen und die reduzierte Spiralfrequenz zu beurteilen.

Montieren Sie unbehandelte Embryonen in geschmolzene Agarose, lassen Sie Agarose erstarren, um die Bewegung einzuschränken, und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Die Motoneuronen exprimieren einen Biosensor mit einer membrangebundenen Spannungsmessdomäne (VSD), die mit Donor- und Akzeptorfluorophoren fusioniert ist.

Die Depolarisation verändert die VSD-Konformation und bringt die Fluorophore näher zusammen.

Bei der Anregung überträgt der Donor Energie auf den Akzeptor, was zu einer Fluoreszenzemission des Akzeptors führt.

Fügen Sie den Blocker hinzu, um die Depolarisation zu hemmen, was die Akzeptoremission reduziert und die Blocker-vermittelte Hemmung der spontanen Depolarisation in den Neuronen bestätigt.

Für die spontane Schwanzspiralanalyse werden die Embryonen in eine 90 Millimeter große runde Petrischale gegeben, die mit Fischwasser mit 0,2 % DMSO gefüllt ist, und mit zwei Juwelierzangen mit scharfen Spitzen oder Nadeln manuell dechorioniert. Inkubieren Sie die Embryonen anschließend 5 Minuten lang bei 28 Grad Celsius. Erkennen Sie mit einer Digitalkamera, die an einem Stereomikroskop montiert ist, das Aufwickeln des Hecks bei Raumtemperatur während einer einminütigen Videoaufnahme.

Erfassen Sie als Nächstes die Zeitreihe mit einer Zeitauflösung von 30 Bildern pro Sekunde. Berechnen Sie dann die Häufigkeit des spontanen Schwanzwindens, indem Sie die Anzahl der Biegungen pro Zeiteinheit zählen. Um die Wirkung des Medikaments Riluzol zu bewerten, übertragen Sie die Embryonen in eine neue 90-Millimeter-Petrischale, die mit Fischwasser gefüllt ist und 5 mikromolare Riluzol enthält. Inkubieren Sie die Embryonen dann 5 Minuten lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie ein einminütiges Video aufnehmen und die Verhaltensanalyse durchführen.

Montieren Sie nun die 20 bis 24 hpf großen Embryonen in 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Fischwasser in einer 35 Millimeter großen Bildgebungsschüssel mit Glasboden bei 37 Grad Celsius. Richten Sie die Embryonen auf die Seite und warten Sie, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt ist.

Bringen Sie dann die Bildgebungsschüssel auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops. Identifizieren Sie die Motoneuronen, die den Biosensor exprimieren, indem Sie monomeres Umikinoko-Green mit einem 488-Nanometer-Argonlaser anregen. Stellen Sie dann die Emission zwischen 495 und 525 Nanometern ein und drücken Sie die Aufnahmetaste.

Für eine FRET-Messung regen Sie mUKG, den Donator des FRET-Paares, mit einem 488-Nanometer-Laser an. Gleichzeitig wird mit Hilfe von zwei Photomultipliern die vom Donor emittierte Fluoreszenz und die vom monomeren Kusabira-Orange-Akzeptor emittierte Fluoreszenz detektiert. Optimieren Sie zu Beginn des Experiments die Verstärkung und den Offset des Photomultipliers 1, in dem die mUKG-Fluoreszenz aufgezeichnet wird, und halten Sie sie während der gesamten Sitzung konstant.

Um den Versatz festzulegen, ändern Sie die Farbe des Bildes mithilfe der Q-Lookup-Tabelle in die Intensitätswerte. Verwenden Sie beim Scannen bei ausgeschaltetem Laser den Offset-Schieberegler, sodass die Hintergrundpixel eine Intensität haben, die etwas höher als Null ist. Schalten Sie den Laser mit derselben Nachschlagetabelle ein. Verwenden Sie während des Scannens den Schieberegler "Verstärkung", um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, und achten Sie darauf, gesättigte Pixel zu vermeiden.

Wählen Sie im Software-Erfassungsfenster den xyt-Erfassungsmodus und eine Bildfeldgröße von 512 x 64 Pixeln aus dem Dropdown-Menü aus. Stellen Sie dann die Aufzeichnung der Änderungen der Spannung des Spinalneurons des Embryos so ein, dass eine Minute lang alle 30 Millisekunden eine einzelne xy-Ebene erfasst wird. Bewerten Sie die Wirkung der Verabreichung von Riluzol auf die Membrandepolarisation im selben Neuron und erfassen Sie einen neuen Datensatz fünf Minuten nach der Zugabe von Fischwasser, das 5 mikromolare Riluzol enthält.