Gleichzeitige optische und elektrophysiologische Überwachung von neuronalen Zellen in Hirnschnitten

Beginnen Sie mit der Perfusionsperfusion einer belüfteten künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) über einem Netzgitter

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Übertragen Sie eine Gehirnscheibe mit fluoreszierenden Protein-exprimierenden Neuronen und verankern Sie sie mit einem platinverdrahteten Gerät.

Drehen Sie das Netzgitter für die Ausrichtung.

Senken Sie die Mehrkanalsonde in Richtung der Scheibe ab.

Passen Sie den Filterwürfel für die Visualisierung fluoreszierender Proteine an.

Drehen Sie die Scheibe, um die Sonde auszurichten.

Stellen Sie die Sondenhöhe unterhalb der Gewebeoberfläche ein.

Perfusionieren Sie nun den aCSF und konzentrieren Sie sich auf die fluoreszenzmarkierten Neuronen.

Fokussieren Sie sich mit einem Hochleistungsobjektiv auf das Gewebe und stellen Sie das Anregungslicht ein.

Verwenden Sie einen geeigneten Lichtfilter, um die Fluoreszenz in Neuronen zu beobachten.

Stellen Sie die Objektivlinse so ein, dass Platz für die Patch-Pipette bleibt, und üben Sie positiven Druck aus.

Positionieren Sie als Nächstes die Pipette in der Nähe des Neurons, um ein Membrangrübchen zu bilden.

Wenden Sie schließlich einen schwachen Sog an, um eine Membrandichtung zu erzeugen, gefolgt von einem starken Sog, um die Membran zu durchbrechen und elektrische Aufzeichnungen vom Zielneuron zu erhalten.

Um die Mehrkanalsonde in den ex vivo Hirngewebe-Objektträger zu platzieren, perfundieren Sie blasenförmiges experimentelles ACSF mit drei bis sechs Millilitern pro Minute und übertragen Sie die Gehirnscheibe mit dem interessierenden Bereich auf das Netzgitter in der Perfusionskammer des Mikroskops. Verankern Sie die Gehirnscheibe mit einer Platinharfe. Drehen Sie das Maschengitter so, dass die Linie der Elektrodenkontakte am distalen Ende der Mehrkanalsonde ungefähr senkrecht zur PL-Oberfläche verläuft.

Senken Sie die Mehrkanalsonde unter Breitfeldbeleuchtung und Feinsteuerung des Mikromanipulators in Richtung der Oberfläche der Scheibe ab. Den entsprechenden Filterwürfel zur Visualisierung des fluoreszierenden Reporterproteins aktivieren, das in den Axonendigungen kortikaler Afferenzen exprimiert wird.

Drehen Sie bei Bedarf die Scheibe, um die Sonde genauer an der PL-Oberfläche auszurichten. Positionieren Sie die Sonde knapp über der Ebene der Schnitte, 200 Mikrometer von der endgültigen Zielposition entlang der x-Achse entfernt, und lassen Sie mindestens einen Kanal außerhalb des zu erfassenden Gewebebereichs. Führen Sie die Sonde langsam entlang ihrer Längsachse in die Scheibe ein.

Um eine Schädigung des Gewebes zu minimieren, schieben Sie die Sonde nur so weit vor, dass die scharfen Spitzen gerade noch unter der Gewebeoberfläche sichtbar sind. Schalten Sie die experimentelle ACSF-Quelle auf die Kontrolllösung in Beuteln um und identifizieren Sie die fluoreszenzmarkierte Zelle für eine gezielte Patch-Clamp-Aufzeichnung. Beschränken Sie die Blende auf den kleinsten Durchmesser und schalten Sie das Hochleistungs-Wasserimmersionsobjektiv ein, wobei Sie darauf achten, dass kein Kontakt zwischen der Mehrkanalsonde und der Objektivlinse entsteht. Bringen Sie das Gewebe in den Fokus.

Zentrieren Sie das Licht auf einen Gewebebereich, der an die Mehrkanalsonde angrenzt, diese aber nicht überlappt. Aktivieren Sie das entsprechende Filterset, um die Bildgebung von Zellen zu ermöglichen, die den Cre-abhängigen Fluoreszenzmarker exprimieren. Heben Sie die Objektivlinse an, um ausreichend Platz zum Absenken einer Patch-Pipette zu schaffen.

Laden Sie eine Patch-Pipette mit interner Lösung und montieren Sie sie auf den Elektrodenhalter. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um einen Überdruck auszuüben, der etwa 0,1 Milliliter Luft entspricht. Senken Sie die Patch-Pipette in die Lösung, bringen Sie die Spitze unter visueller Führung in den Fokus und erhalten Sie eine Ganzzellaufzeichnung von der Zielzelle.