Bestimmung einer Test-Wachstumshormon-Wirkung auf Kisspeptin-Neuronen mit einer Ganzzell-Patch-Klemme

Sichern Sie einen transgenen Hypothalamusschnitt der Maus in einer mit aCSF perfundierten Aufnahmekammer.

Die Scheibe enthält fluoreszierende Fusionsprotein-exprimierende Kisspeptin-Neuronen, die für die Regulation des Fortpflanzungssystems entscheidend sind.

Eine Mikropipette, bestehend aus einer Aufzeichnungselektrode, wird in eine interne Lösung eingebaut

Lokalisieren Sie mikroskopisch ein fluoreszierendes Kisspeptin-Neuron.

Üben Sie positiven Druck auf die Pipette aus und schieben Sie sie in Richtung des Zielneurons. Bei Kontakt entsteht durch den Druck eine Vertiefung auf der neuronalen Membran.

Üben Sie einen kurzen Unterdruck aus, wodurch eine hochohmige Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Membran entsteht.

Stellen Sie die Haltespannung auf das physiologische Ruhepotential des Neurons ein, um genaue Messungen zu ermöglichen.

Wenden Sie kurze Unterdruckimpulse an, um die Membran zu durchbrechen und eine Ganzzellkonfiguration herzustellen.

Bestätigen Sie die Lebensfähigkeit des Neurons, indem Sie die Parameter überwachen.

Führen Sie ein Test-Wachstumshormon ein, das Signalwege auslöst und Veränderungen des Membranpotentials des Neurons induziert.

Messen Sie die Veränderungen des Membranpotentials, um die hemmende Wirkung des Wachstumshormons auf die neuronale Aktivität zu bestimmen.

Übertragen Sie ein Hirnstück von Interesse nacheinander mit einer Acryl-Transferpipette in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit einem Schnittanker fest, damit sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt. Positionieren Sie die Scheibe mit der stromsparenden Objektivlinse des Tauchmikroskops 10x oder 20x in der Mitte der Aufnahmekammer.

Die Position der Scheibe ist entscheidend, um eine gute Sicht auf die gewünschte Region unter dem Mikroskop zu ermöglichen und die Mikropipette perfekt zu greifen. Nachdem Sie die interessierende Region lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse 63x und fokussieren Sie auf die Gewebeebene, indem Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptin-Zellen auf der Oberfläche des Gehirnschnitts zu lokalisieren.

Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format wie ein Quadrat über den interessierenden Bereich zeichnen. Der markierte Computerbildschirm hilft dabei, die Position der Aufzeichnungsmikropipette zur Zelle zu führen. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Aufzeichnungsmikropipette in den Elektrodenhalter ein, wobei Sie sicherstellen, dass die interne Lösung in Kontakt mit der Silberelektrode ist.

Üben Sie einen Überdruck aus, bevor Sie die Mikropipette in die aCSF-Lösung eintauchen, indem Sie eine luftgefüllte Spritze von 1 bis 3 Millilitern verwenden, die über einen Polyethylenschlauch mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, um zu verhindern, dass Schmutz in die Mikropipette eindringt. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unter die Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten des Mikromanipulators, um die X-, Y- und Z-Achse der Mikropipette in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.

Passen Sie den Fokus so an, dass die Spitze der Mikropipette sichtbar ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nahe an die Schnittstelle. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene ab, um sicherzustellen, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Zelloberfläche oder die Zielregion berührt.

Üben Sie mit der luftgefüllten 1- bis 3-Milliliter-Spritze leichten positiven Druck aus, um Schmutz aus dem Annäherungsweg zu entfernen, und bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der x-, y- und z-Achse, um die Mikropipettenspitze näher zu bringen und die Zielzelle zu berühren, was durch den ausgeübten Druck ein Grübchen verursacht. Nachdem Sie das Grübchen festgestellt haben, üben Sie mit Hilfe des Spannungsklemmenmodus in der Software 1 bis 2 Sekunden lang einen schwachen kurzen Sog mit dem Mund durch das mit dem Mikropipettenhalter verbundene Rohr aus, um die Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen.

Wenn die Dichtung etwa eine Minute lang mechanisch stabil bleibt, ohne dass es zu Störgeräuschen kommt, wird die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der interessierenden Zelle eingestellt. Für Kisspeptin-Hypothalamus-Neuronen wird minus 50 Millivolt empfohlen. Wenden Sie als Nächstes einen kurzen Sog mit dem Mund an, um die Plasmamembran an der Mikropipettenspitze zu brechen, die mit der Zelle versiegelt ist, damit die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft oder einen großen Membranteil oder die Zelle anzieht.

Eine adäquate Ganzzellenkonfiguration kann erreicht werden, indem eine Absaugung mit ausreichender Kraft durchgeführt wird. Überprüfen Sie die manuell verwendeten Systemeinstellungen. Aktivieren Sie nach dem Aufbrechen der Zellmembran die Option Ganze Zelle im Spannungsklemmmodus und klicken Sie auf den Auto-Befehl, der sich auf die Registerkarte Ganze Zelle bezieht.

Überprüfen Sie anschließend die Parameter für die Zellviabilität in der Software, wie im Textmanuskript beschrieben. Überwachen Sie während der Experimente den Widerstand der Serie und die stationäre Kapazität der Zellen. Sobald die Ganzzellenkonfiguration richtig erreicht ist, messen Sie die synaptischen Ströme im Voltage-Clamp-Modus. Aufzeichnung der Änderungen des Ruhemembranpotentials und der induzierten Variationen des Ruhemembranpotentials im aktuellen Clamp-Modus.