Lichtevozierte postsynaptische Reaktionen in Neuronen von Netzhautschnitten von Mäusen

Nehmen Sie einen dunkeladaptierten Netzhautschnitt einer Maus in einer Aufnahmekammer in einem dunklen Raum. Die Netzhaut sitzt auf einer stützenden künstlichen Unterlage, die über ein Deckglas gelegt ist. Perfusionieren Sie die Scheibe mit aCSF.

Das retinale neuronale Netzwerk umfasst Photorezeptoren, die synaptisch mit bipolaren Zellen verbunden sind, die mit Ganglienzellen synapsieren.

Positionieren Sie eine Aufnahmepipette in der Nähe der Netzhaut.

Üben Sie unter einem Mikroskop einen positiven Druck aus, während Sie sich einer Zielganglienzelle nähern.

Schalten Sie auf Unterdruck um, um ein Membranpflaster einzuziehen, und brechen Sie es dann, um eine Kontinuität mit dem Zytoplasma herzustellen.

Im Dunkeln bleibt die Photorezeptormembran depolarisiert, was zur Freisetzung von Neurotransmittern führt.

Neurotransmitter, die an bipolare Zellrezeptoren binden, lösen den Verschluss von Kationenkanälen aus und hemmen die Signalübertragung.

Wenden Sie einen Lichtimpuls an, um die Photorezeptoren zu hyperpolarisieren. Die verminderte Freisetzung von Neurotransmittern löst die Öffnung der Kationenkanäle in bipolaren Zellen aus.

Der

Kationeneinstrom induziert die Freisetzung von Neurotransmittern, die an Ganglienzellrezeptoren binden und ein exzitatorisches postsynaptisches Potenzial erzeugen, das von der Pipette aufgezeichnet wird.

Für Patch-Clamp-Aufnahmen grundieren Sie die Perfusionsschläuche mit Ames-Medium und lassen Sie alle Blasen aus dem Schlauch strömen. Nachdem Sie Pipetten mit einem Glasabzieher aufgenommen haben, füllen Sie die Spitze mit Pipettenlösung auf. Verwenden Sie anschließend einen Mikropipettenfüller, um etwa ein Drittel der Pipette zu füllen. Bewahren Sie jede Pipette nach dem Befüllen in einem feuchten Pipettenkasten auf.

Schalten Sie als Nächstes die Ausrüstung für Patch-Clamp-Aufnahmen ein, einschließlich Computer, Verstärker, CCD-Kamera und Mikroskop. Bei Arbeiten bei Dunkelheit legen Sie mit Hilfe eines Infrarotbetrachters eine Netzhautschnittpräparation auf den Mikroskoptisch. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Perfusion.

Stellen Sie die Perfusionstemperatur auf 33 bis 37 Grad Celsius ein. Betrachten Sie die Schnittoberfläche mit einer CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf die Zielposition, an der sich die Zielzelltypen befinden. Wählen Sie eine fehlerfrei aussehende Zelle für die Patch-Clamp-Aufzeichnung aus. Sobald eine gesunde Zelle identifiziert wurde, legen Sie eine Aufzeichnungspipette in einen Pipettenhalter und führen Sie die Pipette zur Scheibenvorbereitung vor.

Wenn es sich in der Nähe der Schnittvorbereitung befindet, suchen Sie die Spitze der Pipette mit einem Mikroskop. Sobald die Pipettenspitze unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle. Stellen Sie als Nächstes den Verstärker ein und stellen Sie die Pipette auf Picoampere 5 Volt pro Nanoampere ein. Zwei kontinuierliche elektrische Impulse von ca. 5 Millivolt und ca. 10 Hertz starten und den Pipettenwiderstand prüfen.

Ein idealer Widerstand liegt zwischen 5 und 12 Megaohm für die meisten retinalen Neuronen. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie ein Mundstück oder eine Spritze, um die innere Lösung auszublasen, bis die Spitze der Pipette auf der Oberfläche der Zielzelle liegt. Wenn der Überdruck ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche hinterlässt, schieben Sie die Spitze leicht nach vorne und hören Sie auf zu blasen.

Wenn der Pipettenwiderstand kontinuierlich ansteigt, lassen Sie ihn stehen und überwachen Sie den Widerstand, bis er größer als 1 Gigaohm ist. Wenn der Widerstand nicht spontan zunimmt, üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, bis er zu einem Gigaseal wird. Nachdem die Gigadichtung erreicht ist, ändern Sie das Haltepotenzial auf minus 70 Millivolt.

Üben Sie dann intermittierend Unterdruck aus, um die Membran in der Pipettenspitze zu zerreißen. Wenn die Ganzzellenkonfiguration vorgenommen wird, kann der Pipettenwiderstand zwischen 500 Megaohm und einem Gigaohm liegen, und der kapazitive Strom ist beobachtbar. Zeichnen Sie das I-U-Verhältnis von minus 80 bis 40 Millivolt auf. Je nach Zellentyp werden unterschiedliche Arten von spannungsgesteuerten Kanälen aktiviert. Zeichnen Sie schließlich lichtevozierte synaptische Ströme oder Spannungen auf.