Kombinierte Aufzeichnung der mechanisch stimulierten afferenten Ausgabe und der Markierung der Nervenenden in Haarfollikeln von Mäusen

Beginnen Sie mit einer präparierten Maus-Ohrmuschel oder einem Außenohr, dessen verbundene Nerven freigelegt sind.

Führen Sie den für die Aufzeichnung vorgesehenen Nerv in die Aufnahmeelektrode ein.

Entfernen Sie die Fettschicht in der Nähe des Ohrmuschelrands, um die Basis der Haarfollikel freizulegen, und falten Sie dann die Haut, um die Haare zur Stimulation freizulegen.

Positionieren Sie eine mechanische Stimulationssonde, um die Haare zu berühren und abzulenken.

Diese Stimulation aktiviert sensorische Nervenenden, öffnet mechanisch gesteuerte Ionenkanäle, ermöglicht einen positiven Ioneneinstrom und erzeugt Aktionspotentiale.

Durch diese Enden breiten sich die Aktionspotentiale zu dem Nerv aus, der aufgezeichnet wird. Visualisieren Sie das Signal.

Fügen Sie als Nächstes einen fluoreszierenden Farbstoff hinzu und setzen Sie die Haarstimulation fort.

Der Farbstoff bindet an die stimulierten neuronalen Membranen und wird über Endozytose internalisiert, ohne die neuronale Aktivität zu beeinflussen.

Nach der Stimulation waschen, um ungebundene Farbe zu entfernen.

Fügen Sie ein Sequestriermittel hinzu, um den nicht internalisierten membrangebundenen Farbstoff zu entfernen.

Visualisieren Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die Verfärbung in den Haarfollikeln, um mechanisch stimulierte Nervenenden zu identifizieren.

Um kontrollierte Aufzeichnungen von reizevozierten Aktionspotentialen zu machen, verwenden Sie eine mechanische Sonde aus feuerpoliertem 10-Zentimeter-Borosilikat-Mikroelektrodenglas, die an einem keramischen piezoelektrischen Aktuator befestigt ist. Positionieren Sie die Sonde so, dass sie sich parallel zur Hautfalte bewegt und die Haare und nicht die Haut berührt. Platzieren Sie es etwa einen halben bis einen Millimeter über der Hautoberfläche. Überprüfen Sie dann die Stimulation manuell, indem Sie auf die Audioausgabe achten, wenn sich die Sonde bewegt.

Richten Sie nun die Software so ein, dass sie die mechanische Stimulation eines kleinen Haarbereichs steuert. Programmieren Sie zum Beispiel alle 10 Sekunden dreisekündige Stimulationen mit fünf Hertz-Sinuskurven. Dies erfordert eine Sondenverschiebung zwischen 200 und 2000 Mikrometern. Fahren Sie dann mit wiederholter automatisierter Stimulation fort, um die Konsistenz der aufgezeichneten Reaktionen in den Nerven zu überprüfen. Wiederholbare Ergebnisse sollten erreichbar sein.

Wenn die Ergebnisse konsistent sind, verringern Sie die Wiederholungsrate auf alle 30 Sekunden. Weitere Anweisungen finden Sie im Textprotokoll. Um die Eigenschaften der mechanosensorischen Kanäle zu untersuchen und die mechanosensorischen Endungen um die Haarfollikel herum zu markieren, geben Sie 10 mikromolare FM143 in die Lösung und lassen Sie sie 60 Minuten einwirken, während Sie die Haare weiterhin mit der oszillierenden Sonde stimulieren.

Dieser Farbstoff blockiert mögliche Wandlerkanäle in sensorischen Neuronen, in Kultur und in Cochlea-Haarzellen. Es blockiert jedoch nicht das Feuern in reifen Haarfollikelafferenzen in situ. Die Markierung der Enden zeigt, dass der Farbstoff als Endverschlüsse fungiert, die während der gesamten Farbstoffexposition weiterhin auf mechanische Stimulation reagieren.