Automatisierte bildgeführte Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung von Neuronen in Hirnschnitten

Beginnen Sie mit einem immobilisierten Gehirnschnitt in einer Aufnahmekammer.

Fokussieren Sie mit der kameragesteuerten Software eines Mikroskops auf den Zielbereich

Schalten Sie das Anregungslicht ein und nehmen Sie mehrere Bilder in unterschiedlichen Tiefen auf.

Die Software erkennt die Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen.

Positionieren Sie nun die mit Lösung gefüllte Patch-Pipette mit der Aufzeichnungselektrode in der Kammer.

Verwenden Sie eine geeignete Software, um die Positionsregler zu kalibrieren.

Kalibrieren Sie die Regler bei hoher Vergrößerung neu, um die fluoreszenzmarkierte Zelle präzise anzuvisieren.

Wählen Sie die Koordinaten der Zielzelle aus.

Starten Sie das automatische Absenken der Patch-Pipette.

Der Computer überwacht den Widerstand über die Elektrode. Üben Sie einen negativen Druck aus, eine Erhöhung des Widerstands aufgrund des Kontakts der Pipette mit der Zellmembran deutet auf die Bildung von Gigasealen hin.

Anschließend verringert die Software den Druck weiter, um die Zellmembran zu durchstechen und eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu erhalten.

Platzieren Sie in diesem Schritt eine Gehirnscheibe in der Mitte der Aufnahmekammer. Stabilisieren Sie den Hirnschnitt mit einem Slice Holdown oder einer Harfe. Um die Fluoreszenzzelle zu erkennen, suchen Sie den interessierenden Bereich unter der vierfachen Vergrößerung. Bewegen Sie dann den Mikroskoptisch, indem Sie den "Click-to-Move"-Modus aktivieren, und klicken Sie auf die Mitte des Interessenbereichs. Wechseln Sie als Nächstes zum Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie den Fokus ein, indem Sie das Mikroskop mit RF auf der Tastatur in der z-Achse bewegen.

Die Software steuert das Mikroskop in der Kamera, um eine Reihe von Bildern in unterschiedlichen Tiefen aufzunehmen. Dann werden diese Bilder einer Computer-Vision-Verarbeitung unterzogen, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu finden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zelle erkennen in der Hauptspalte, Einheit Null. Eine Liste der Zellenkoordinaten wird in der Benutzeroberfläche der Speicherposition angezeigt. Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie auf die Schaltfläche X neben den Koordinaten klicken.

Klicken Sie dann auf die gewünschte Zelle. Auf der Zelle erscheint ein gelber Punkt mit einer Zahl, und die Koordinaten der Zelle werden in der GUI der Speicherposition angezeigt. Um eine Sekundärkalibrierung durchzuführen und die Pipetten-Offset-Koordinaten zu ermitteln, füllen Sie ein Drittel einer Glaspipette mit interner Lösung. Legen Sie dann die Pipette auf den Pipettenhalter, der am Kopftisch befestigt ist.

Bei geringer Vergrößerung verwenden Sie die Tastenkombination eins und zwei, um zwischen Einheit eins und Einheit zwei zu wechseln. Bringen Sie dann die Pipette in das Gesichtsfeld und stellen Sie den Fokus über die Tastatur ein.

Laden Sie anschließend die primäre Kalibrierung, indem Sie auf Lastkalibrierung klicken. Schalten Sie das Mikroskopobjektiv auf eine hohe Vergrößerung um und klicken Sie 40 Mal auf die Hauptbenutzeroberfläche. Bringen Sie die Pipettenspitze in die Mitte. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche für die sekundäre Kalibrierung in der Hauptbenutzeroberfläche unter dem Gerät, das verwendet wird. Um eine Zielzelle zu patchen, klicken Sie auf die Schaltfläche Patch Control, um die Patch Control-GUI zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Gehe zu neben der gewünschten Zelle in der Koordinatenliste in der Benutzeroberfläche für die Speicherposition.

Klicken Sie anschließend auf die CTM-Schaltfläche des Geräts in der Hauptbenutzeroberfläche, um die Bewegung zu aktivieren. Klicken Sie auf die gewünschte Zelle, um die Pipettenspitze in die Zelle zu bewegen.

Verwenden Sie anschließend die Taste Unit 1 Selected, um das Eingangssignal zwischen den beiden Einheiten umzuschalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Patch in der Patch-Control-GUI. Das automatische Patchen beginnt, und der Druck und der Widerstand können auf der Patch-Control-GUI überwacht werden.

Der automatische Patching-Algorithmus überwacht den Widerstand und steuert den Druck durch eine Reihe von Logikschleifen, um einen Gigaseal zu bilden. Ein Pop-up-Fenster benachrichtigt über die Bildung eines Gigaseals.

Das System nutzt die Widerstandsänderung, um den Kontakt mit der Zelloberfläche zu erkennen. In einer Situation, in der der Kontakt mit der Zelloberfläche nicht rechtzeitig erkannt wird, verwenden Sie die Schaltfläche Weiter, um die Patchphase zu beschleunigen, während Sie sich im selben automatischen Patching-Versuch befinden.

Sie können den automatischen Prozess jederzeit manipulieren, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der Patch-Control-GUI klicken. Wählen Sie dann Ja aus, um mit kombiniertem Zap und Saugen einzubrechen. Speichern Sie dann das Patchprotokoll des Experiments.