Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, muskarinische Antagonisten auf die LAL-Muskeln erwachsener Mäuse zu verabreichen und morphologische Veränderungen der njs als Reaktion auf die Hemmung muskarinerger Acetylcholinrezeptoren zu untersuchen. Zunächst werden muskarinische Antagonisten subkutan mit der gewünschten Häufigkeit und Dauer verabreicht. Nach der Tötung werden die behandelten LAL-Muskeln sorgfältig präpariert und sämtliches Bindegewebe abgetrennt.

Das Muskelgewebe wird anschließend dreifach immunmarkiert, um die motorischen Nervenscheidenzellen und nikotinischen Acetylcholinrezeptoren mittels standardmäßiger immunhistochemischer Methoden sichtbar zu machen. Abschließend kommt die konfokale Mikroskopie zum Einsatz, um morphologische Veränderungen der NMJ in mit muskarinischen Antagonisten behandelten Muskeln zu untersuchen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die morphologische Organisation der dreigliedrigen NMJ durch die Hemmung muskarinischer Acetylcholinrezeptoren stark gestört ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verabreichung pharmazeutischer Substanzen an die Skelettmuskulatur der Hintergliedmaßen von Nagetieren, beispielsweise des Musculus gastrocnemius und des Musculus tibialis anterior, besteht darin, dass der Musculus levator auris longus (LAL) besser zugänglich und relativ dünn ist. Dies ermöglicht die wiederholte lokale Applikation von Wirkstoffen und die Visualisierung nahezu aller Nervenfasern innerhalb des Muskels. Auf einer mit Ethanol gereinigten Laborbank lösen Sie die geeignete Dosis eines muskarinischen Acetylcholinrezeptorantagonisten in steriler physiologischer Kochsalzlösung in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf. Ziehen Sie 50 Mikroliter der Lösung mit einer Ein-Kubikzentimeter-Insulinspritze auf, wobei Sie für jede Maus eine separate Spritze verwenden.

Bereiten Sie außerdem Spritzen vor, die nur physiologische Kochsalzlösung für jede Maus in der Kontrollgruppe enthalten, und bewahren Sie alle Spritzen gekühlt auf Eis auf, bis sie injiziert werden. Anschließend betäuben Sie die Mäuse mit einem Ketamin-Xylazin-Cocktail. Überprüfen Sie die Narkose mittels der Zehenquetschtechnik. Nach ausreichender Sedierung rasieren Sie das Haar im kranialen Kopfbereich bis hin zum Nackenbereich ab und entfernen Sie verbliebenes Haar mit 70 %igem Ethanol. Stellen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop und führen Sie die Spritzennadel parallel zum LAL-Muskel ein, sodass die Spitze den kaudalen Bereich bedeckt.

Ziehen Sie vorsichtig an der Nadel der Spritze, um sicherzustellen, dass die Nadel in das überliegende Bindegewebe eingeführt ist und den LAL-Muskel selbst nicht direkt beschädigt. Beginnen Sie langsam, die Lösung über dem rechten LAL-Muskel zu injizieren, während Sie die Spritze über einen Zeitraum von etwa einer Minute zurückziehen. Bei korrekter Injektion sollte sich die Lösung zu einer Kuppel in der darüberliegenden Haut ausbilden, die mindestens eine Stunde lang bestehen bleibt.

Wiederholen Sie den Vorgang alle 12 Stunden für einen bis sieben Tage vor der Muskelpräparation. Danach euthanasieren und die Maus mit der Bauchseite nach unten in eine Präparierschale heften. Führen Sie den ersten Schnitt ausschließlich durch die Haut mit kleinen Federpräparierscheren entlang des linken LAL von der Region direkt proximal zum Ohr bis zur Region um den linken Schulterblattansatz durch. Entfernen Sie vorsichtig die Haut in diesem Bereich, vermeiden Sie jedoch, zu nahe am rechten Ohr zu schneiden, da dies einer der Ansatzpunkte für den rechten LAL-Muskel ist.

Suchen Sie mit kleinen Feder-Scheren den zentral gelegenen Streifen aus Fettgewebe auf der Oberfläche des Kopfes, dort, wo die rechte und linke LAL-Muskulatur zusammentreffen. Schneiden Sie einen Zentimeter rechts neben dem Fettgewebe entlang der proximalen Kante des linken LAL-Muskels in Richtung linkes Ohr bis hinunter zur Schulter. Nach dem Einschnitt wird der rechte LAL-Muskel mit kleinen Pinzetten zurückgeklappt, um die ventrale Seite des Muskels freizulegen.

Entfernen Sie das Bindegewebe und die Faszie, während Sie vorsichtig mit der Pinzette am rechten LAL-Muskel anheben. Schneiden Sie um das Kaudalende des rechten LAL an der Basis des Ohres herum und arbeiten Sie in Richtung des rostralen Endes des rechten Ohrs. Halten Sie den rechten LAL dabei umgeklappt.

Es ist besser, in diesem Schritt mehr Gewebe einzuschließen, als das Risiko einzugehen, die LAL selbst zu beschädigen. Falls der Muskel beginnt, auszutrocknen, pipettieren Sie einen XPBS über den Muskel.

Legen Sie das präparierte rechte LAL in eine 30 mm große Kulturkorkschale, die mit XPBS gefüllt ist, mit der dorsalen Seite nach oben. Befestigen Sie die vier Ecken des Muskels mit kleinen Insektennadeln unter Verwendung kleiner Pinzette und einer Feder-Schere. Entfernen Sie das Bindegewebe von der dorsalen Oberfläche des rechten LAL-Muskels.

Drehen Sie den Muskel um und heften Sie ihn erneut fest, um die ventrale Oberfläche zu reinigen. Zwei bis drei Muskeln können nach der Übernachtinkubation in derselben 30-Millimeter-Schale für eine dreifache Immunfärbung platziert werden. Inkubation mit dem primären Antikörper.

Waschen Sie die Muskeln in einem XPB S3 dreimal für jeweils 10 Minuten und geben Sie dann das Cocktail aus sekundären Antikörpern in der Blockierungslösung für eine Stunde hinzu. Inkubieren Sie die Muskeln bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, um eine Photobleichung zu verhindern. Nach der einstündigen Inkubation waschen Sie die Muskeln in einem XPB S3 dreimal für jeweils 10 Minuten. Nach dem letzten Waschgang unter dem Stereomikroskop halten Sie die Muskeln mit frischem einem XPBS bedeckt, entfernen Sie jegliches verbleibende Bindegewebe und schneiden Sie anschließend die seitlichen Ränder des LAL ab.

Montieren Sie das Muskelgewebe mit der dorsalen Seite nach oben auf dem Objektträger. Geben Sie anschließend zwei bis drei Tropfen Eindeckmedium hinzu. Legen Sie Deckgläser auf und befestigen Sie diese mit klarem Nagellack.

Schützen Sie die Objektträger vor Licht und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereitstehen. Aufnahmen mit hoher Vergrößerung mittels konfokaler Mikroskopie eines dreifach immunmarkierten Maus-NMJ zeigen die dreigliedrige Organisation. Die feinen Endäste, die sich von einem einzelnen Axon stammen und mit NFS V zwei gefärbt sind, werden eng von den Zellkörpern terminaler Schwann-Zellen und deren Fortsätzen umhüllt, wie durch die S-100-Färbung postsynaptisch sichtbar wird.

Bei einer Muskelzelle liegt ein Haufen von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren exakt gegenüber den Verzweigungen der Nervenendigungen und terminalen Schwann-Zellen. Im LAL-Muskel einer mit Vehicle behandelten Maus sind NJs zu erkennen, deren dreigliedrige Organisation ungestört ist und die die typischen hochdifferenzierten Verästelungen der Nervenendigungen aufweisen, wie durch eine dreifache Immunfärbung gezeigt. Im Gegensatz dazu wird die strukturelle und funktionelle Integrität dieser dreigliedrigen Organisation durch die tägliche Applikation von vier Dampf stark beeinträchtigt.

Ein subtypspezifischer muskarinischer Acetylcholinrezeptor-Inhibitor. Hier führt eine feuchte Reizung zur selektiven Eliminierung von Nervenendigungen aus zahlreichen Nervenfasern über die gesamte Muskeloberfläche. Zusätzlich sind terminale Schwann-Zellen abnorm inaktiv, wie durch intensive S-100-Färbung ohne Ausbildung von Fortsätzen belegt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man muskarinische Antagonisten auf LAL-Muskeln appliziert und die Muskeln dreifach immunfärbt, um morphologische Veränderungen von njs als Reaktion auf die Hemmung dieser Rezeptoren zu untersuchen.