Name: Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie die subkutane Verabreichung von Muscarin-Antagonisten und Triple-Immunfärbung des Levator Auris longus bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung morphologischer Veränderungen neuromuskulärer Verbindungen.

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Diese Arbeit wurde von Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320) unterstützt.

1. Die subkutane Verabreichung von Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten <ol><li> Bereiten Sie unter aseptischen Bedingungen die entsprechende Dosis von mAChR-Antagonist, (vgl. Tabelle), indem man das Medikament in steriler physiologischer Kochsalzlösung in 1,5 ml Reaktionsgefäß. Die folgenden Antagonisten wurden verwendet: Atropin, Methoctramin, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Draw 50 ul Lösung in a1cc Insulinspritze und eine separate Spritze für jede Maus. Auch bereiten Spritzen mit physiologischer Kochsalzlösung nur für jede Maus in der Kontrollgruppe. Keep Spritzen auf Eis, bis die Injektion bereit. </li><li> Anesthetize Mäuse mit Ketamin-Xylazin-Cocktail (120 mg / kg Ketamin, 8 mg / kg Xylazin) Check für eine angemessene Narkosetiefe durch die Beobachtung Mangel an Reaktion auf Prise Zeh. </li><li> Nach ordnungsgemäßer Sedierung, rasieren Behaarung des rostralen Bereich des Kopfes bis zum kaudalen Bereich des Halses, wischen restlichen Haare weg mit 70% Ethanol. </li><li> Bewegen Sie die Maus unter Stereomikroskop, und legen Nadel parallel zur LAL Muskel während Hochziehen leicht auf die Nadel der Spritze (Abb. 1A, B). Dies gewährleistet, dass die Nadel in darüber liegenden Bindegewebes eingesetzt wird und nicht direkt beschädigt LAL Muskel selbst. Führen Sie die Nadel so, dass die Spitze deckt den kaudalen Bereich des LAL Muskel. </li><li> Ganz langsam beginnen, Lösung über das Recht LAL Muskel injizieren, während Zurückziehen der Spritze, die insgesamt Injektion sollte etwa 1 Minute. Wenn injiziert richtig, sollte die Lösung bilden eine "Kuppel", die etwa 1 cm im Durchmesser ist, in die darüber liegende Haut, die für mindestens eine Stunde bleiben. Ein gleichmäßig eingespritzt Lösung deckt den gesamten rostralen und kaudalen Regionen der rechten LAL Muskel. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang alle 12 Stunden für 1 bis 7 Tagen. Für andere Studien1 benutzten wir das gleiche Protokoll zu injizieren Wachstumsfaktoren alle 12 Stunden für bis zu 21 Tage. Keine anormalen Reaktionen wurden von Mäusen mit Narkose 2x pro Tag für bis zu 21 Tage verabreicht wird. </li></ol> 2. Dissection von LAL Muskeln <ol><li> Euthanize Mäuse mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (390 mg / kg). Der Tod ist durch die Beurteilung Mangel an Herzschlag nach Thorakotomie durchgeführt wird gewährleistet. </li><li> Pin Sie die Maustaste in eine Sektion Gericht, Dorsalseite mit Pin 1 in jeder Pfote und 1 Stift durch die Nase. </li><li> Machen Sie den ersten Schnitt durch die Haut nur mit kleinen Feder Schere zu schneiden entlang der linken LAL aus der Region nur proximal an das Ohr, um die Region rund um das linke Schulterblatt. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Haut in dieser Region, aber vermeiden Schneiden zu nahe an das rechte Ohr, da dies eine der Ansatzstellen für das Recht LAL Muskel. </li><li> Suchen Sie den mittig platzierten Fettgewebe Streifen Lipid entlang der Mittellinie auf der äußeren Oberfläche des Kopfes, wo rechts und links LAL Muskeln zu erfüllen. Mit kleinen Feder Schere, schnitt 1cm auf der rechten Seite das Fettgewebe (in Richtung des linken Ohres) vom proximalen Rand der linken LAL Muskel bis zum Erreichen der Schulter (Abb. 1C). </li><li> Sobald der Schnitt gemacht, Ziehen Sie die richtigen Muskeln LAL mit kleinen Zange auf die Bauchseite des Muskels freizulegen. Trim das Bindegewebe und Faszien während vorsichtiges Ziehen an der rechten LAL Muskel mit einer Pinzette (Abb. 1C). </li><li> Cut um den kaudalen Ende des rechten LAL an der Basis des Ohres. Weiter Schnitt, Bewegung in Richtung des rostralen Ende des rechten Ohres, halten das Recht LAL umgedreht (Abb. 1C).. Es ist besser, mehr Gewebe bei diesem Schritt als Gefahr der Beschädigung der LAL selbst gehören. Wenn der Muskel beginnt zu trocknen, Pipette 1X PBS in den Muskel. </li><li> Legen Sie seziert Recht LAL in 30mm Kultur Sylgard Schale mit 1X PBS, Rücken nach oben. Pin unten vier Ecken des Muskels mit kleinen Insekten Pins. </li><li> Mit Hilfe von kleinen Zangen und Scheren Frühjahr, sauber Bindegewebe aus dorsalen und ventralen Flächen der rechten LAL Muskel. Schalten Muskel wieder und wieder-pin, um sauber aus Ventralfläche. 3.2 Muskeln können in der gleichen 30mm Schale gelegt werden. </li></ol> 3. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 1 <ol><li> Vor Beginn der Immunfärbung, bereiten alle notwendigen Reagenzien. 1X PBS, 2% Rinderserumalbumin BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS benötigt werden. Pre-cool Methanol in -20 ° C Gefrierschrank. </li><li> Lassen Sie LAL Muskeln in der Schüssel Dorsalseite während dieses Prozesses merken. Discard 1X PBS-Lösung und fügen genug 4% (PFA), um den Muskel zu decken. Legen Gericht auf Schüttler gesetzt bei Drehzahl 2 oder 3 für 20 Minuten. Soweit nicht anders vermerkt, sollte das Gericht auf einem Schüttler für die folgenden Schritte gesetzt werden. </li><li> Discard 4% PFA und waschen den Muskel mit 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils. </li><li> Discard letzten 1X PBS waschen und fügen 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS-Lösung für 30 '. </li><li> Discard 0,1 M Glycin-Lösung eined add 1X PBS mit Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin bei einer Konzentration von 1:200 für 15 '. </li><li> Discard α-Bungarotoxin Lösung und waschen Muskel in 1X PBS, 3 mal 10 'jeweils. </li><li> Permeabilisieren Gewebe, indem vorgekühlt Methanol und die Schale in der -20 ° C Gefrierschrank für genau 5 Minuten, kein Schütteln erforderlich. </li><li> Entfernen Methanol und 3 x waschen 10 'jeweils mit 1X PBS. Discard letzten Wasch-und Block-Gewebe mit 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS für 1 Stunde. Das Waschen und Blockierung Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> Inkubieren Sie die Muskeln über Nacht, Zittern, bei 4 ° C in einer Mischung aus Primär-Antikörper in Blocking-Lösung (vgl. Tabelle) verdünnt. </li></ol> 4. Triple-Immunfärbung von LAL NMJs: Tag 2 <ol><li> Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils bei Raumtemperatur. </li><li> Add-Cocktail Sekundärantikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur (vgl. Tabelle). Die Muskeln müssen vor Licht von diesem Schritt weiter geschützt werden Foto-Bleiche von Alexa-Fluor 647-Fluoreszenz zu verhindern. </li><li> Wash Muskeln in 1X PBS 3 mal, 10 'jeweils. </li><li> Reinigen Sie verbleibende Bindegewebe in 1X PBS, schneiden Sie die seitlichen Grenzen der LAL Muskeln und Montage auf Folien Dorsalseite auf, die Verwendung von Glas Deckgläschen und Montage Medien. Verwenden Sie klare Nagellack Deckglas fixieren. </li><li> Schützen Sie Folien aus Licht und bei -20 ° C bis zur Analyse bereit. </li></ol> 5. Konfokale Bildgebung von LAL NMJs <ol><li> Hochauflösende konfokale Bilder sind mit einem Leica Plan Apo 63X Öl-Objektiv (1.4NA) auf einem Leica TCS 4D konfokalen Mikroskop erreicht. </li><li> Fluorescein und Alexa 647-Signale wurden gleichzeitig mit Laserlinien 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) und 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW) gescannt bzw.. Sequenziell ist Rhodamine Signal wird dann mit der Laserlinie 561 nm (DPSS, 561, 20 mW) gescannt. Optische Schnitte wurden mit 0,3 &amp;mgr; Abständen gesammelt, und die Anzahl der Bilder in der z-Ebene von 60 bis 80 variiert. Die Lochkamera ist Airy 1 (107,97 um) angepasst. Das Bildformat 1024 x 1024 (X, Y), mit einem Zoom-Faktor von 1, bei 400Hz Geschwindigkeit führt zu einer Bildgröße von 234,32 um x 234,32 um und Pixelgröße von 229,05 nm x 229,05 nm. </li><li> Leica TCS-NT Software zur Erfassung wird dann verwendet, um z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren. </li><li> Multipanel Bilder sind für Helligkeit und Kontrast mit Hilfe von Adobe Photoshop angepasst. </li><li> Für eine typische LAL Muskel, sollte man in der Lage sein ca. 75-100 en face NMJs analysieren. Synaptic Stabilität wird durch Merkmale wie räumliche Ausrichtung der prä-, peri-und postsynaptischen Elementen (zB Nerven, Schwann-Zellen und Muskeln), und Messungen der synaptischen Bereich (dh Synapse Größe) bestimmt. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Bei den erwachsenen Säugetieren NMJ, erarbeitet ein einziger Motor Axon feinen Verästelungen, die sehr differenzierte Lauben einer Nervenendigung (Abb. 2; Green) Form auf einer einzigen Muskelfaser, die genau auf postsynaptische Cluster von Nikotinsäure AChRs (Abb. 2; Red) apposed . Perisynaptically, Terminal Schwann-Zellen eng decken alle Zweige der präsynaptischen Nervenendigungen (Abb. 2, blau). Die strukturelle und funktionelle Integrität dieses dreigliedrige Organisation ist stark gestört durch die tägliche Anwendung von Subtyp-spezifischen mAChR Inhibitoren. In dem hier vorgestellten Beispiel (Abb. 3), beschwört 4-DAMP, ein mAChR-Antagonist mit hoher Affinität für M1, M3, M4 und M5 mAChR-Subtypen, selektive Eliminierung von Nervenendigungen aus zahlreichen NMJs ganzen Muskel Oberfläche (Abb. 3B, C). Darüber hinaus sind Terminal Schwann-Zellen ungewöhnlich ruhig 8 als von hellen S100 Kennzeichnung ohne Prozess-Erweiterung (Abb. 3B ", 3C") belegt. Postsynaptisch sind Muskelfasern normal und es gibt keinen Verlust von nAChRs (Abb. 3B ', 3C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Anatomische Lage und Organisation des LAL Muskel. Lage von rostral (rLAL), caudal (ClaI) und der LAL Nerv (LALn) und entsprechende Endplatte Bands gezeigt werden (A, Einschub). Die Lage und Orientierung der Nadel in Bezug auf die LAL Muskel ist für das Injektionsverfahren (B) dargestellt. Incision Punkte sind für die Dissektion Verfahren (C) gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Tripartite Organisation der NMJ. High-Vergrößerung konfokalen Ansichten einer Maus NMJ. Ein einzelnes Axon erarbeitet feinen Endäste (A), dicht von Terminal Schwann-Zellen und deren Prozesse (A ', Sternchen zeigen Sie auf Terminaldienste Schwann Zellkörper) abgedeckt. Postsynaptisch in einer Muskelfaser, ist eine Ansammlung von Nikotinsäure AChRs genau auf die Zweige des Nervus Terminals apposedSignale und Terminal-Schwann-Zellen. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. LAL Muskeln mit 4-DAMP, ein mAChR-Antagonisten behandelt werden. Low-und High-Vergrößerung konfokalen Blick LAL Muskeln mit Fahrzeug oder 4-DAMP behandelt. Im Gegensatz zu den Vehikel-behandelten Muskeln (A-A'''), zahlreichen NMJs in der 4-DAMP-behandelte Muskel fehlt Nervenendigungen (B-B''', C-C'''). Ein boxed Bereich in Abbildung 2B ist in Abbildung 2C gezoomt.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen <a>1</a> . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von CNTF-beh...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dosis: 120mg/kg </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dosis: 8mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% Reinheit); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Pharmazeutischer Qualität </td></tr><tr><td> Methoctramin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosis: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dosis: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptide Internationalen </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 - 1M </td></tr><tr><td> 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fischer </td><td> T353-500 </td><td> Machen Sie 10% Lösung zunächst durch Auflösen 10g/100mL entionisiertes destilliertes Wasser; machen 4% mit 1X PBS, pH-Wert einstellen auf 7,4 </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbitol </td><td> Virbac Tiergesundheit </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dosis: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Befolgen Sie die Anweisungen, die mit Kit kommen, können mehrere große Kulturschale verwenden (30mm, 60mm, 100mm) je nach Bedarf </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Add 0.185g bis 25 mL von 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% Rinderserumalbumin (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Lösen 2g BSA in 100 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100 mL </td><td> Lösen Sie 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoklonale Antikörper </td><td> SMI312 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Hybridoma der Bank </td><td> SV2-Überstand </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-Ziege-anti-Maus-IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200, aber wenn Hintergrund ist hoch, versuchen 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 647 konjugierten Ziege anti-Kaninchen </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluoreszierenden Eindeckmittel </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td><td> Dies ist keine Hard-Set-Medium, müssen Sie das Deckglas mit klarem Nagellack zu sichern. </td></tr><tr><td> Kleine Frühling Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subkutane verabreichung von muscarinic antagonisten und triple-immunfärbung der levator auris longus in mäuse

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hinterbein Muskeln von Nagetieren, wie gastrocnemius und tibialis anterior, werden häufig für in vivo pharmakologische Studien der Signale für die Bildung und Pflege von Säugetieren NMJs verwendet. Allerdings ist eine medikamentöse Eindringen in diese Muskeln nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung häufig unvollständig oder ungleichmäßig und viele NMJs können, bleiben unberührt. Obwohl die systemische Verabreichung von Geräten wie Mini-Pumpen der raum-zeitlichen Wirkungen verbessern kann, kann die invasive Natur dieses Ansatzes Ursache zu verwechseln entzündliche Reaktionen und / oder direkte Schädigung der Muskulatur. Darüber hinaus ist eine vollständige Analyse der NMJs in einem Hinterbein Muskeln schwierig, weil es zeitaufwendig serielle Schnitte und umfangreiche Immunfärbung erfordert. Die Maus LAL ist ein dünnes, flaches Blatt Muskel oberflächlich auf dem Rücken des Halses befindet. Es ist eine schnell zuckenden, dass die Funktionen auf der Ohrmuschel zu bewegen. Es enthält rostralen und kaudalen Abschnitte, die von der Mittellinie des Schädels stammen und erstrecken sich seitlich auf die knorpeligen Teil jeder Ohrmuschel. Der Muskel wird durch einen Zweig des Nervus facialis, die kaudal Projekte beim Verlassen des Foramen stylomastoideum geliefert. Wir und andere haben herausgefunden, LAL, um eine bequeme Zubereitung, die Vorteile für die Untersuchung von kurz-und langfristigen In-vivo-Wirkungen von Drogen auf NMJs und Muskeln bietet. Erstens erleichtert ihre oberflächliche Lage mehrere lokale Applikationen von Medikamenten unter leichter Betäubung. Zweitens ermöglicht seine Dünnheit (2-3 Schichten von Muskelfasern) Visualisierung und Analyse von fast allen NMJs innerhalb des Muskels. Drittens erlaubt die einfache seziert er mit seinen Nerven intakt zusammen mit dem Muster seiner Innervation ergänzende elektrophysiologische Untersuchungen in vitro 9,5. Last, und vielleicht am wichtigsten, eine kleine applizierte Volumen (~ 50 ul) leicht deckt den gesamten Muskel-Oberfläche sorgt für eine gleichmäßige und bei längerer Exposition aller NMJs auf das Medikament und eliminiert die Notwendigkeit für einen systemischen Ansatz 1,8.

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Die Hinterbeinmuskeln von Nagetieren, wie beispielsweise der Musculus gastrocnemius und der Musculus tibialis anterior, werden häufig für In-vivo-pharmakologische Studien zu den Signalen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, muskarinische Antagonisten auf die LAL-Muskeln erwachsener Mäuse zu verabreichen und morphologische Veränderungen der njs als Reaktion auf die Hemmung muskarinerger Acetylcholinrezeptoren zu untersuchen. Zunächst werden muskarinische Antagonisten subkutan mit der gewünschten Häufigkeit und Dauer verabreicht. Nach der Tötung werden die behandelten LAL-Muskeln sorgfältig präpariert und sämtliches Bindegewebe abgetrennt.Das Muskelgewebe wird anschließend dreifach immunmarkiert, um die motorischen Nervenscheidenzellen und nikotinischen Acetylcholinrezeptoren mittels standardmäßiger immunhistochemischer Methoden sichtbar zu machen. Abschließend kommt die konfokale Mikroskopie zum Einsatz, um morphologische Veränderungen der NMJ in mit muskarinischen Antagonisten behandelten Muskeln zu untersuchen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die morphologische Organisation der dreigliedrigen NMJ durch die Hemmung muskarinischer Acetylcholinrezeptoren stark gestört ist.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verabreichung pharmazeutischer Substanzen an die Skelettmuskulatur der Hinte

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Wiederholte Messungen von Nagetier Atemfunktion und Probenahme von Atemwegs Entzündungszellen sind wünschenswert, aber in der Regel nicht möglich. Hier beschreiben wir eine wiederholbare Methode für oral Intubation Mäuse, wiederholte Messungen der Atemwege Hyperreaktivität und die Entnahme von Atemwegs-inflammatorischen Zellen ermöglicht.

Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Wir haben eine einfache, zuverlässige und relativ kostengünstiges Verfahren zur Intubation bei Mäusen durch direkte Laryngoskopie mit einem Otoskop mit einem 2,0-mm-Spekulum entwickelt. Diese Technik ist atraumatisch und für wiederholte Messungen bei chronischen Experimente eingesetzt werden. Wir finden es besser als zuvor berichtet, Tracheostoma oder chirurgischen Techniken.

Intubation bei Mäusen<em&gt; Über</em&gt; Direkte Laryngoskopie Mit einem Otoskop

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Zwei mikrochirurgische Ansätze zur lokalen Wirkstoffabgabe an das Innenohr werden hier beschrieben und hinsichtlich ihres Einflusses auf Hörparameter, die Cochlea-Zytoarchitektur und die Expression von Entzündungsmarkern verglichen.

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanale Injection

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Lähmung und Opticospinal Entzündung durch Übertragung von Aquaporin-4 (AQP4) induzieren-spezifischen T-Zellen von AQP4- / - Mäusen in WT-Mäuse. Darüber hinaus führen wir serielle optische Kohärenztomographie verwenden, um visuelle System Funktionsstörung zu überwachen.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen verwendet die Maus Levator Auris Longus (LAL) Muskeln, um spontan aufnehmen und Nerv-evozierten postsynaptischen Potenziale (Strom-Klemme) und Ströme (Voltage-Clamp) an der neuromuskulären Synapse. Diese Technik können wichtige Einblicke in die Mechanismen der synaptischen Übertragung unter normalen und Krankheit darstellen.

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Eine Entzündung der Augenoberfläche schädigt das Augenoberflächengewebe und beeinträchtigt lebenswichtige Funktionen des Auges. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer Augenentzündung und zur Sammlung von kompromittiertem Gewebe in einem Mausmodell der Meibom-Drüsendysfunktion (MGD).

Induktion der Augenoberflächenentzündung und Ansammlung von betroffenen Geweben

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Erfahren Sie die subkutane Verabreichung von Muscarin-Antagonisten und Triple-Immunfärbung des Levator Auris longus bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung morphologischer Veränderungen neuromuskulärer Verbindungen.

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

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