Mechanische Schädigung von Drosophila-Larven segmentaler Nerven, um Neurodegeneration auszulösen

Nehmen Sie Drosophila-Larven im dritten Stadium und betäuben Sie sie mit Kohlendioxid.

Positionieren Sie die Larven unter einem Mikroskop mit der Bauchfläche nach oben, um die Segmentnerven sichtbar zu machen.

Diese Nerven enthalten Motoneuronen, die die Körperwandmuskulatur innervieren und die Bewegung der Larven steuern.

Die Axonenden dieser Neuronen verbinden sich mit Muskelfasern zu neuromuskulären Verbindungen oder NMJs.

Die Neuronen setzen Neurotransmitter frei, die an Rezeptoren auf den Muskelfasern binden, was zu einem Ioneneinstrom führt und die Signalübertragung auslöst.

Mit einer Pinzette die ventrale Kutikula einklemmen, um die Segmentnerven zu verletzen und dadurch die Bewegung zu hemmen.

Legen Sie die verletzten Larven auf eine Agarplatte mit Larvenfutter, um das Überleben zu sichern.

Lege den Teller in eine Schale, decke ihn mit einem feuchten Papiertuch ab, um die Feuchtigkeit zu halten, und bewahre ihn in einem Behälter auf, damit sich die Larven erholen können.

Mit der Zeit führt die Verletzung zum Tod der Motoneuronen, der sogenannten Neurodegeneration, die die NMJs stört.

Setzen Sie jede Larve auf ein CO_{2 -}Betäubungsgerät. Rollen Sie jede Larve unter einem Präpariermikroskop vorsichtig auf ihre dorsale Seite, um die segmentalen Nerven in der gesamten Kutikula sichtbar zu machen.

Es ist wichtig, jede Larve vorsichtig auf die Rückenseite zu rollen, um die Segmentnerven durch die Kutikula vor einer Verletzung sichtbar zu machen.

Beginnen Sie an den Maulhaken und positionieren Sie die Pinzette der Größe 5 etwa ein halbes bis 2/3 des Weges entlang der Larvenlänge. Nach der Positionierung kneifen Sie etwa ein Drittel der ventralen Kutikula mit einer Pinzette der Größe 5 zusammen, die die Segmentnerven enthält. Um sicherzustellen, dass die Segmentnerven der Larven verletzt werden, wenden Sie genügend Kraft an, um die Segmentnerven zu zerquetschen, aber lassen Sie die Kutikula intakt. Um die richtige Kraftmenge zu bestimmen, zerquetschen Sie 10 Larven und stellen Sie sicher, dass die Sterblichkeitsrate nach fünf Stunden unter 50 % liegt.

Nach der Verletzung werden die Larven vorsichtig auf eine Fruchtsaft-Agar-Platte mit ca. 0,5 g Hefepaste umgefüllt. Platzieren Sie jede Larve so, dass ihr vorderes Ende auf der Hefepaste liegt, um sie weiter zu füttern. Legen Sie Agarplatten mit Hefepaste und 10 verletzte Larven auf den Boden einer leeren 100 x 15 Millimeter großen Petrischale. Decken Sie die Petrischale mit einem feuchten Papiertuch ab und achten Sie darauf, dass das Papiertuch weder die Larven noch die Agarplatten berührt. Stellen Sie dann die Petrischale in einen luftdichten Behälter bei Raumtemperatur. Entnehmen Sie schließlich Larven zur Dissektion nach bestimmten Zeiträumen nach der Verletzung.