Erzeugung dopaminerger neuronaler Organoide aus humanen embryonalen Stammzellen

Nehmen Sie humane embryonale Stammzellen oder hES-Zellen in einem mit extrazellulärer Matrix beschichteten Kolben.

Ersetzen Sie das Medium durch ein neuronales Induktionsmedium und inkubieren Sie, wobei die hES-Zellen in Kolonien von neuralen Vorläuferzellen oder NPCs differenziert werden.

Fügen Sie eine enzymatische Lösung hinzu, um die Kolonien zu dissoziieren.

Zentrifugieren, den Überstand entfernen und die Zellen in einem Induktionsmedium mit Wachstumsfaktoren resuspendieren, um die NPC-Differenzierung zu unterstützen.

Geben Sie die Zellsuspension auf inverse pyramidenförmige Mikrovertiefungen, um dreidimensionale Neurosphären zu bilden.

Übertragen Sie Neurosphären auf eine mit extrazellulärer Matrix beschichtete Platte, die ein Differenzierungsmedium mit Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen enthält. Inkubieren Sie unter Unruhe, um die Differenzierung in dopaminerge Vorläuferneuronen zu fördern.

Ersetzen Sie das Medium durch ein neuronales Reifungsmedium und platzieren Sie die Neurosphären auf einer Membranscheibe in einem Kultur-Well-Einsatz, um die Diffusion von Luft und Nährstoffen zu ermöglichen.

Inkubieren Sie unter statischen Bedingungen, um dreidimensionale Organoide zu bilden, die aus reifen dopaminergen Neuronen bestehen.

Diese Organoide, die ein sich entwickelndes Gehirn nachahmen, sind nützlich für die Untersuchung der dopaminergen Neuronendegeneration, ein Merkmal der Parkinson-Krankheit.

Ersetzen Sie das Stammzellmedium, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenzmerkmale von hES-Zellen verwendet wird, durch ein serumfreies Medium, das einen dualen SMAD-Hemmungscocktail enthält, um die neuronale Induktion zu starten, und einen 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor, um die Überlebensrate der Zellen während der Passage am nächsten Tag zu erhöhen. Bereiten Sie die Mikrotiterplatte am ersten Tag mit 2,5 Millilitern serumfreiem Medium pro Vertiefung vor, das die gleiche Konzentration an ROCK-Inhibitor und dualen SMAD-Hemmmolekülen enthält.

Um die Zellen in Richtung des Ventralmusters des Neuralrohrs zu differenzieren, fügen Sie SHH und FGF8 mit 100 Nanogramm pro Milliliter und zwei mikromolare geglättete Agonisten hinzu. Nach der Zugabe des Mediums zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1.200 mal g, um Luftblasen aus den Mikrovertiefungen zu entfernen. Sobald die Mikrotiterplatte mit halbem Differenzierungsmedium verwendet werden kann, entfernen Sie das Medium von hES-Zellen und waschen Sie es schnell mit kalzium- und magnesiumchloridfreiem PBS.

Dissoziieren Sie die Kolonien in eine einzellige Suspension, indem Sie 7,5 ml rekombinante enzymatische Lösung in einen T75-Kolben geben. Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fügen Sie dann 7,5 Grad DMEM F-12 hinzu. Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 mal g. Entfernen Sie dann den Überstand und zählen Sie die Zellen in demselben Medium, das zur Vorbereitung der Mikrotiterplatte verwendet wurde.

Passen Sie das Mediumvolumen an, um eine Zellsuspension zu erhalten, die es ermöglicht, Neurosphären mit 1.000 Zellen pro Mikrotiterplatte zu bilden, indem Sie 4,7 Millionen Zellen in 2,5 Millilitern Medium vorbereiten und es zu den vorherigen 2,5 Millilitern Medium hinzufügen, die bereits in der Platte platziert sind. Um die Zellen richtig in jeder Mikrovertiefung zu verteilen, schütteln Sie die Platte vorsichtig und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 mal g. Als nächstes inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um Kugeln zu erzeugen.

Spülen Sie die Mikrowells am zweiten Tag vorsichtig mit Medium und geben Sie die Kugeln in eine gewebebehandelte Sechs-Well-Platte. Stellen Sie die Kugeln bei 37 Grad Celsius in Rotation und wechseln Sie die Hälfte des Mediums alle zwei bis drei Tage durch frisches Medium. An Tag 3 bis 13 ergänzen Sie das Medium mit drei mikromolaren GSK-3-beta-Inhibitoren, um die neuronale Induktion zu verbessern und in neuronale Vorläuferzellen mit einer Mittelhirnidentität umzuwandeln. Teilen Sie die Probe in zwei neue, gewebebehandelte Platten mit sechs Vertiefungen auf, um die Kugeldichte zu reduzieren und eine Kugelaggregation zu vermeiden.

Beginnen Sie am achten Tag die neuronale Reifung, indem Sie auf ein neues Medium mit Wachstumsfaktoren wechseln und das Medium alle zwei bis drei Tage wechseln. Setzen Sie an Tag 21 eine Kulturplatte in eine Vertiefung einer neuen Sechs-Well-Platte ein und fügen Sie 1,2 Milliliter neuronales Reifungsmedium hinzu, das für die Neurosphärendifferenzierung verwendet wird, unter den Membraneinsatz. Legen Sie dann die PTFE-Membran auf einen Kulturplatteneinsatz.

Um das neuronale Organoid zu erzeugen, säen Sie schließlich etwa 100 Neurosphären unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen auf der PTFE-Membran aus. Stoppen Sie die Rotation ab diesem Schritt und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis der gewünschte Differenzierungszeitpunkt erreicht ist.