JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:29 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Kulturschale mit befruchteten Zebrafischembryonen in einem Embryomedium.
Positionieren Sie die Schale unter einem Stereomikroskop und verwenden Sie eine Präparierzange, um das Chorion, die äußere Membran, die die Embryonen umgibt, zu entfernen.
Dadurch können die Embryonen dem umgebenden Medium ausgesetzt werden.
Übertragen Sie diese dechorionierten Embryonen in eine Schale, die Embryomedium mit einem Medikament enthält, das die Cholesterinsynthese hemmt, die für die Aufrechterhaltung der Integrität der Blutgefäße des Gehirns entscheidend ist.
Inkubieren Sie bei kontrollierter Temperatur, bis sich die Embryonen zu Larven entwickeln.
Im Laufe der Zeit dringt das Medikament in die sich entwickelnden Larven ein und hemmt die Cholesterinsynthese.
Cholesterinmangel schwächt die Blutgefäße des Gehirns, wodurch sie platzen und Blut in das Gehirn austreten, wodurch hämorrhagische Flecken entstehen.
Beobachten Sie die Larven unter einem Stereomikroskop.
Trennen Sie die hämorrhagischen Larven mit deutlichen roten Flecken von einer nicht-hämorrhagischen Population.
Übertragen Sie diese hämorrhagischen Larven für weitere Studien in eine neue Schale.
24 Stunden nach der Befruchtung verwenden Sie unter einem Hellfeld-Stereomikroskop eine scharfe, ultradünne Dissektionszange, um die Embryonen für die Atorvastatin-Behandlung zu dechorionieren. Geben Sie dann 30 Milliliter E3-Embryomedium in zwei saubere Petrischale, eine für die Behandlung und die andere für die Kontrolle. Nehmen Sie 60 Mikroliter Embryowasser aus der Behandlungsschale und fügen Sie 60 Mikroliter 0,5 millimolares Atorvastatin hinzu, um 80 % der blutenden Larven zu erreichen.
Übertragen Sie mit einer Pasteur-Pipette 100 Embryonen in so wenig Wasser wie möglich in jede Schale. Inkubieren Sie die beiden Schalen bei 28 Grad Celsius. Verwenden Sie jederzeit nach 50 Stunden nach der Befruchtung unter dem Mikroskop eine Pasteurpipette, um blutende Fische vorsichtig von nicht blutenden Populationen zu trennen und die Larven in neue Schalen mit frischem E3-Medium zu übertragen.
Um die Trennung von blutungspositiven Larven zu erleichtern, könnten Sie Fische ohne Pigment oder Fische verwenden, die fluoreszierendes Protein in roten Blutkörperchen exprimieren.