Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Boten-RNAs in einzelnen Neuronen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem einzelne Neuronen mit einem Patch-Clamping und einer Aufzeichnung versehen und dann das Zytoplasma von jedem aufgezeichneten Neuron aus der Mr.mRNA und dem Zytoplasma vollständig aspiriert werden. CD NA wird mittels PCR hergestellt und amplifiziert.

Letztendlich können spezifische mRNAs für Rezeptoren, Ionenkanäle und Enzyme mit einem herkömmlichen Gel-Imaging-System nachgewiesen werden. Mein Name ist, ich arbeite am Health Science Center der University of Tennessee. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Anzahl der MRTs in einem einzelnen Neuro extrem klein ist und leicht verloren geht.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie mit einem Vibrator 300 Mikrometer dicke koronale Hirnschnitte schneiden, die den mittleren rostralen Teil des substanziellen Nigra enthalten. Das Gehirn kann von 15 bis 40 Tage alten Spra-Dolly-Ratten isoliert werden. Das Schneiden von Scheiben wird eiskalt in einer Schneidlösung mit hohem Saccharosegehalt durchgeführt, die mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid angereichert ist, und bei einem pH-Wert von 7,4, die Scheiben in künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit inkubieren und mit einem 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoffgas beblasen.

Halten Sie die Temperatur bei 34 Grad Celsius und lassen Sie die Scheiben dort 45 Minuten stehen. Bewahren Sie dann die Gehirnscheiben bis zur Aufnahme bei Raumtemperatur auf. Beginnen Sie damit, ein Hirnschnitt in eine Patch-Clamp-Aufnahmekammer zu übertragen.

Kontinuierlich durchblutet mit sauerstoffhaltiger künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit bei 32 Grad Celsius. Füllen Sie die Patch-Pipetten mit intrazellulärer Autoklavlösung, die mit DNAs und RNAs freiem Wasser hergestellt wurde. Senken Sie eine beladene Pipette in das Bad.

Vergewissern Sie sich, dass der Widerstand zwischen zwei und drei Megaohm liegt. Lokalisieren Sie zunächst die substantielle Nigra anhand ihrer ausgeprägten und anatomischen Lage. Wählen Sie dann mit einer Namar-Optik und einem 60-fach-Objektiv große Zellen im SNC und SNR für die Aufzeichnung aus.

Dabei handelt es sich ohne zu zögern um dopaminerge oder GABAerge Neuronen. Verwenden Sie eine herkömmliche Ganzzellenkonfiguration mit gigadichter Abdichtung, um die Stromzange und die Spannungsklemme herzustellen. Diese Aufzeichnungen sollten in der Regel in weniger als fünf Minuten durchgeführt werden, um den mRNA-Abbau zu minimieren.

In etwa einer Minute ist es möglich, elektrophysiologische Fingerabdrücke für die interessierenden Neuronen zu erstellen, indem nur ihre Membran- und Spike-Eigenschaften aufgezeichnet werden. Nachdem Sie Daten von einem Neuron von Interesse erhalten haben, verwenden Sie einen sanften Mundsauger, um das Zytoplasma abzusaugen. Die dichte Versiegelung sollte nicht wie sonst gebrochen werden.

Extrazelluläre Ablagerungen, einschließlich mRNA, können in die Patch-Pipette gesaugt werden und den Zellinhalt kontaminieren. Extrusieren Sie den Zellinhalt in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen, indem Sie die Pipettenspitze brechen und leichten positiven Druck ausüben. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie das Röhrchen sofort in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad, um eine Kontamination mit extrazellulären Ablagerungen auszuschließen, die mRNAs enthalten könnten.

Führen Sie eine Negativkontrolle durch, indem Sie den Inhalt einer Patch-Pipette sammeln, die ohne Aspiration in das Gewebe abgesenkt wird. Nach dem Sammeln von Zellinhalten von 10 bis 20 Neuronen beginnt sofort die reverse Transkriptionsreaktion. Um den Abbau der mRNAs zu minimieren, beginnen Sie mit der Verdauung von kontaminierter genomischer DNA mit DNAs, eine für fünf Minuten, bei 25 Grad Celsius.

Dieser Schritt ist entscheidend für die Reduzierung potenzieller Fehlalarme und sollte nicht umgangen werden. Dann inaktivieren Sie die DNA eins mit 1,2 Mikrolitern 25 Millimolar EDTA und inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Verwenden Sie nun ein kommerziell erhältliches Kit zur Synthese von CD-NA, um zu überprüfen, ob die genomische DNA vollständig entfernt wurde.

Führen Sie eine Kontrollreaktion jeder Probe ohne reverse Transkriptase durch. Während alle anderen Reaktionskomponenten gleich bleiben. Lagern Sie die Produkte bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für das PCR-Design benötigt werden.

Primer entsprechend den Sequenzen in der Gen-Bank führen, wann immer möglich, T Intro-übergreifende Prime-Reparaturen durch, um genomische DNA-Kontaminationen zu erkennen. Um die Wirksamkeit der Primerpaare zu überprüfen, testen Sie sie in der ersten Stufe an CD NA des gesamten Gehirns. Bei der PCR werden fünf Mikroliter der 30 Mikroliter CDNAs für 35 Zyklen unter Verwendung eines Standardprotokolls für thermische Zyklen amplifiziert.

Für die zweite Stufe wird ein Mikroliter des PCR-Produkts der ersten Stufe mit der gleichen Prime-Reparatur amplifiziert und ein leicht modifiziertes Zyklusprofil verwendet. Trennen Sie nun die Produkte auf einem 2,5%AGROS Gel und visualisieren Sie sie mit AUM Bromid oder Gel grün. Unter UV-Licht werden die positiven DNA-Banden herausgeschnitten und mit einem im Handel erhältlichen Kit sequenziert, um die DNA zu sammeln.

Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Neuronen in den substantiellen Nigra, Pars, Compacta und Pars reticulata wurden verglichen. SNR GABAerge Neuronen wiesen eine höhere Frequenz auf, ein spontanes Spiking bei etwa 10 Hertz. Die Spikes hatten eine Basisdauer von etwa einer Millisekunde bei der hyperpolarisierenden Strominjektion.

SNR GABAerge Neuronen zeigten eine subtile SAG-Reaktion, die auf einen wöchentlich aktivierten Strom hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten die ngro-dopaminergen Neuronen niederfrequente spontane Spikes mit einer Basendauer von etwa drei Millisekunden. Dopaminerge Neuronen zeigten auch eine ausgeprägte SAG als Reaktion auf Hyperpolarisation, was auf eine starke Expression des IH-Stroms in SNR GABAergen Neuronen hinweist, nicht jedoch in dopaminergen Neuronen.

Einzelzell-R-T-P-C-R detektierte mRNA für Glutaminsäure-Decarboxylase, ein Schlüsselenzym in der GABA-Synthese. Im Gegensatz dazu identifizierte a dopaminerge SNC- und SNR-Neuronen, jedoch nicht in GABAergen Neuronen. Einzelzell-R-T-P-C-R detektierte mRNA für Tyrosinhydroxylase, ein Schlüsselenzym für die Dopaminsynthese.

Als nächstes wurde die Einzelzelle R-T-P-C-R verwendet, um die Expression von spannungsaktivierten KV-Dreikanal-Untereinheiten zu profilieren, die die Eigenschaften von spannungsgesteuerten Kaliumkanälen variieren. Im Beispiel SNR gaba wurden Neuronen-mRNAs für KV 3.1, 3.2, 3.3 und 3.4 nur in einem S-N-R-D-A-Beispiel-Neuron nachgewiesen. KV 3.2, 3.3 und 3.4 wurden in gepoolten Daten nachgewiesen.

KV 3.1 wurde in SNR GABAergen Neuronen häufiger nachgewiesen als in nigro dopaminergen Neuronen, was auf ein höheres Expressionsniveau von KV 3.1 in den schnellen Viking SNR GABA-Neuronen hinweist. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Handschuhe zu tragen und die Werkzeuge nach ihrer Entwicklung wissenschaftlich frei zu halten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Expression und Funktion von Rezeptoren und Ionenkanälen im Nervensystem zu erforschen.