JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:10 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie einen kortikalen Schnitt aus einem transgenen Mäusegehirn, das lichtaktivierte Kationenkanäle in exzitatorischen Pyramidenneuronen des Kortex exprimiert.
Sichern Sie die Scheibe in einer Aufnahmekammer und durchbluten Sie sie mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
Führen Sie eine Aufzeichnungselektrode in die oberflächliche kortikale Schicht ein und zeichnen Sie die neuronale Grundaktivität auf.
Führen Sie ein anfallsauslösendes Medikament ein, das spannungsgesteuerte Kaliumkanäle blockiert, den Kaliumabfluss verhindert und die Neuronen in einem übererregbaren Zustand hält.
Die übererregbaren Neuronen erzeugen spontan Ausbrüche von Aktionspotentialen, die als iktale Ereignisse bezeichnet werden, und zwar über einen längeren Zeitraum.
Um ictale Ereignisse bei Bedarf zu erzeugen, legen Sie einen kurzen Lichtimpuls an, um die Kationenkanäle an den exzitatorischen Pyramidenneuronen zu aktivieren.
Der resultierende Kationeneinstrom erzeugt Aktionspotentiale, die die Ausschüttung von exzitatorischen Neurotransmittern auslösen.
Diese Neurotransmitter binden an Rezeptoren auf postsynaptischen Neuronen und verursachen einen Zustrom von Kationen.
Der Zustrom führt zu Ausbrüchen des Aktionspotentials, die für kurze Zeit iktale Ereignisse erzeugen.
Schneiden Sie bei diesem Verfahren Linsenpapier aus, das etwas größer ist als die Gehirnscheibe. Verwende eine Pipette mit breitem Durchgang oder einen Detaillierungspinsel, um eine Gehirnscheibe auf das ausgeschnittene Linsenpapier zu übertragen, das mit einer Zahnpinzette an Ort und Stelle gehalten wird. Übertragen Sie dann das Linsenpapier mit einer Gehirnscheibe in die Aufnahmekammer und fixieren Sie es mit einem Harfensieb.
Anschließend wird der Gehirnschnitt in der Aufnahmekammer mit karbogeniertem ACSF bei 35 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute perfundiert. Verwenden Sie ein digitales Thermometer, um sicherzustellen, dass die Aufzeichnungskammer 33 bis 36 Grad Celsius hat. Füllen Sie dann die Glaselektroden mit einer Hamilton-Spritze mit 10 Mikrolitern ACSF auf.
Führen Sie unter dem 20-fachen Stereomikroskop die Aufzeichnungsglaselektrode mit manuellen Manipulatoren in die oberflächliche kortikale Schicht 2/3. Betrachten Sie die elektrische Aktivität des Gehirnschnitts mit Standardsoftware. Um elektrographische anfallsähnliche Aktivitäten zu induzieren, perfundieren Sie den Hirnschnitt mit ACSF, das 4-AP bei 100 Mikromolaren enthält. Betrachten Sie die elektrische Aktivität des Gehirnschnitts mit Standardsoftware.
Um elektrographische anfallsähnliche Ereignisse mit Hilfe einer optogenetischen Strategie auf den Gehirnschnitten von optogenetischen Mäusen zu erzeugen, verwenden Sie einen manuellen Manipulator, um eine optische Faser mit einem Kerndurchmesser von 1.000 Mikrometern direkt über dem Aufnahmebereich zu positionieren. Wenden Sie einen kurzen Impuls aus blauem Licht an, um ein iktales Ereignis auszulösen.