Viral-vermittelte Markierung und Transplantation von medialen ganglionären Eminenzzellen für in vivo Studien

Entnahme des medialen ganglionären Eminenzgewebes, das kortikale Interneuronen-Vorläuferzellen enthält, aus genetisch veränderten Mausembryonen.

Fügen Sie ein kationisches Polymer hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe in eine einzellige Suspension.

Fügen Sie lentivirale Vektoren hinzu, die einen Cre-Rekombinase-abhängigen GFP-Reporter tragen, der von Lox-Stellen flankiert wird. Ausbrüten.

Das Polymer neutralisiert die Ladungen der Virus- und Wirtszellmembran und ermöglicht so die virale Fusion und RNA-Freisetzung.

Die virale RNA wird reverse-transkribiert und in das Wirtsgenom integriert.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Überschüssiges Medium aufnehmen.

Übertragen Sie die Zellen auf eine hydrophobe Oberfläche und laden Sie sie in eine Injektionsvorrichtung.

Injizieren Sie die Zellen in die Hirnrinde eines betäubten Mauswelpen.

Lassen Sie den Welpen sich erholen und wachsen.

Die transplantierten Vorläuferzellen differenzieren sich zu reifen Interneuronen in der Hirnrinde.

Eine Untergruppe dieser Interneuronen exprimiert Cre-Rekombinase und RFP.

In diesen Interneuronen schneidet Cre die Lox-Stellen heraus, schaltet das GFP-Gen um und ermöglicht seine Expression.

Visualisieren Sie die RFP- und GFP-Co-Expression, um Cre-exprimierende Interneuronen zu identifizieren.

Nach der Aufbereitung des Lentivirus und der Präparierung des MGE gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll werden beide Hemisphären des MGE entnommen und das Gewebe in zwei 1,5-Milliliter-Entnahmeröhrchen gegeben, die 500 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS enthalten.

Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis das gesamte Gewebe entnommen ist. Übertragen Sie dann die Rohre in eine BSL-2-zertifizierte Haube. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab, ohne das MGE-Gewebe zu stören, das sich am Boden des Röhrchens absetzt.

Geben Sie dann ca. 500 Mikroliter vorgewärmtes DMEM mit 10 % FBS-Medien hinzu. Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 Mikrogramm pro Milliliter zugeben und durch eine P1000-Pipettenspitze titrieren, bis eine Einzelzellsuspension erreicht ist. Geben Sie dann 15 bis 20 Mikroliter des konzentrierten Lentivirus in jedes Röhrchen.

Verschließen Sie anschließend jedes Röhrchen sicher, drehen Sie es zum Mischen um und legen Sie dann alle Röhrchen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 30 Minuten, aber nicht länger als eine Stunde mit dem Lentivirus, da längere Zeiten zu einer verminderten Lebensfähigkeit der Zellen geführt haben. Drehen Sie die Schläuche alle 10 Minuten um.

Nehmen Sie nach der Inkubation die Röhrchen aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 700 mal g bei 4 Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie in der BSL-2-Haube den Überstand und entsorgen Sie ihn in 10 % Bleichmittel. Fügen Sie anschließend 1 Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzu und titrieren Sie das Pellet zwei- bis dreimal, um es zu waschen.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach dem Zentrifugieren wie zuvor noch zwei bis drei Mal, um überschüssige Viren zu entfernen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche so viel Medium wie möglich und legen Sie jede Tube auf Eis.

Aufgrund von Medienresten an den Seiten des Röhrchens werden bis zum Beginn des Transplantationsverfahrens etwa 2 bis 3 Mikroliter des Mediums das Zellpellet bedecken. Achten Sie darauf, dass durchgehend eine sterile Technik verwendet wird, ziehen Sie das Mineralöl in eine 1-Milliliter-Spritze auf und füllen Sie dann die Glaspipette mit einer 30,5-Gauge-Nadel vollständig mit dem Mineralöl auf.

Befestigen Sie dann die Glaspipette an der stereotaktischen Vorrichtung und laden Sie sie auf den Kolben. Bewegen Sie den Kolben mit einem Helfer über den hydraulischen Antrieb etwa zur Hälfte in die Glaspipette und entfernen Sie das auslaufende Mineralöl mit einem sauberen Papiertuch.

Drehen Sie anschließend die Ecke eines sterilen Papiertuchs zu einer feinen Spitze und entfernen Sie damit vorsichtig überschüssige Medien über dem MGE-Zellpellet. Dadurch wird die Zelldichte konzentriert, so dass kleinere Injektionsvolumina erreicht werden können.

Verwenden Sie anschließend eine P2-Pipette, um das Zellpellet langsam aufzuziehen und ein- bis zweimal zu titrieren, bevor Sie es auf eine hydrophobe Oberfläche abgeben. Das Volumen sollte knapp 1 Mikroliter betragen.

Bewegen Sie die Spitze der Nadel in die Zellsuspension und ziehen Sie die Zellsuspension mit Hilfe des hydraulischen Antriebs in die Pipette hoch. Nachdem Sie einen Welpen durch Unterkühlung betäubt haben, überprüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie, indem Sie die Haut zwischen den Zehen mit einer Zange einklemmen. Es sollte keine Reaktion zu sehen sein.

Legen Sie als Nächstes den Welpen auf eine Form, die sich unter dem Injektionsgerät befindet, und straffen Sie die Haut, indem Sie die Haut am Kopf zurückziehen und dann mit Standard-Laborklebeband sichern. Manipulieren Sie den stereotaktischen Arm schnell, um die Spitze der Glaspipette senkrecht zur Kopfoberfläche des Welpen auf dem Kopf des Welpen zu positionieren.

Wenn die Pipette mit dem Kopf in Kontakt kommt, betrachten Sie dies als Null. Schieben Sie dann die Pipette durch die Oberfläche der Haut und des Schädels in die Hirnrinde. Führen Sie dann die Pipette ein und ziehen Sie sie zweimal zurück, bevor Sie sie stoppen.

Um Zellen gezielt in den Neokortex zu bringen, werden Injektionen durchgeführt, wenn sich die Mikropipette in einer Tiefe von 0,1 Millimeter befindet. Sobald die Nadel in Position ist, drehen Sie die hydraulische Vorrichtung, um den Kolben in die Glaspipette zu schieben, und injizieren Sie 50 bis 70 Nanoliter pro Stelle.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an drei bis sechs verschiedenen Stellen auf unterschiedlicher rostral-kaudaler Ebene, wenn eine breite Verteilung der transformierten Zellen im gesamten Neokortex erforderlich ist. Wenn die Injektionen abgeschlossen sind, nehmen Sie den Welpen aus dem Stadium und markieren Sie ihn gemäß den zugelassenen Verfahren.

Sobald sich das Jungtier erholt hat und in der Lage ist, sich selbstständig zu bewegen, setzen Sie es zurück zu dem säugenden Weibchen und dem Rest des Wurfes. Überprüfen Sie die Welpen nach dem Eingriff und am nächsten Tag, um sicherzustellen, dass es keine Anzeichen einer Verschlechterung des Gesundheitszustands gibt.