Messung der Dopaminaufnahme in Synaptosomen des Gehirns von Mäusen mit radioaktiv markiertem Dopamin

Gewinnen Sie Synaptosomen, membrangebundene Strukturen, die von den intakten präsynaptischen Enden neuronaler Synapsen stammen, die Dopamintransporter (DAT) enthalten, aus einem Mäusegehirn.

Füllen Sie die Reagenzgläser mit Puffern, die Liganden enthalten, und die Referenzröhrchen mit Puffer, die Liganden und einen DAT-Inhibitor enthalten.

Fügen Sie die Synaptosomen hinzu.

Die Liganden hemmen Dopamin-abbauende Enzyme und andere Transporter und verhindern so den Dopaminabbau und die unspezifische Aufnahme.

Führen Sie unmarkiertes und radioaktiv markiertes Dopamin ein.

Im Testzustand nimmt die synaptosomale DAT das Dopamin auf.

In der Referenzbedingung verhindert der Inhibitor die DAT-vermittelte Dopaminaufnahme und lässt nur eine Hintergrundaufnahme zu.

Geben Sie die Proben in Mikrofaserfilter, die die Synaptosomen zurückhalten.

Waschen, um ungebundenes Dopamin zu entfernen.

Übertragen Sie die Filter in Szintillationsröhrchen.

Szintillationsflüssigkeit hinzufügen, die eine strahlenempfindliche Verbindung enthält.

Legen Sie die Röhrchen in einen Szintillationszähler.

Radioaktive Emissionen von Dopamin regen die Verbindung dazu an, Licht zu emittieren, was mit dem Zähler gemessen wird.

Subtrahieren Sie die Referenz von den Testdaten, um die synaptosomale Dopaminaufnahme zu messen.

In diesem Schritt fügen Sie 440 Mikroliter Aufnahmepuffer, Ligand und Kokain zu 12 dafür vorgesehenen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und 440 Mikroliter Aufnahmepuffer und Ligand zu den 36 verbleibenden 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Beschriften Sie 6 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 und 0,31. Geben Sie dann 750 Mikroliter Aufnahmepuffer und Liganden in die 5 Mikrozentrifugenröhrchen mit der niedrigsten Anzahl.

Geben Sie als nächstes 1.455,4 Mikroliter Aufnahmepuffer und Ligand, 14,6 Mikroliter unmarkiertes Dopamin und 30 Mikroliter tritiiertes Dopamin in das mit 10 gekennzeichnete Röhrchen. Übertragen Sie anschließend 750 Mikroliter der Mischung aus dem Röhrchen mit der Bezeichnung 10 in das Röhrchen mit der Bezeichnung 5. Gut mischen und 750 Mikroliter der Mischung aus diesem Röhrchen in das mit 2,5 gekennzeichnete Röhrchen übertragen. Wiederholen Sie diese Verdünnung mit den restlichen Röhrchen.

Spülen Sie danach die Glas-Mikrofaserfilter mit 4 Millilitern Aufnahmepuffer vor, nachdem Sie sie auf einen 12-Well-Filtereimer gelegt haben. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der synaptosomalen Membransuspension in die ersten 24 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 440 Mikrolitern Puffer. Vorsichtig vortexen und kurz herunterdrehen, um sicherzustellen, dass die Synaptosomen in den Puffer eingetaucht sind.

Lassen Sie sie dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach 10 Minuten 50 Mikroliter Dopamin von 10 Mikromolaren und 5 Mikromolaren in die ersten 2 Spalten und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Stoppen Sie die Reaktion nach 5 Minuten, indem Sie 1 Milliliter eiskalten Aufnahmepuffer hinzufügen. Wiederholen Sie dies mit den 2,5 Mikromolaren und 1,25 Mikromolaren und dann mit den 0,62 Mikromolaren und 0,31 Mikromolaren.

Geben Sie die Proben in die vorgespülten Mikrofaserfilter und waschen Sie sie mit 5 x 4 Millilitern eiskaltem Aufnahmepuffer. Nachdem die ersten 12 Proben zu den Filtern hinzugefügt wurden, setzen Sie die Filter in die Szintillationsröhrchen ein. Wiederholen Sie dies mit den nächsten 12 Proben. Bereiten Sie maximal 3 Zählröhrchen vor, indem Sie einen Mikrofaserfilter in den Boden der Szintillationsröhrchen 49 bis 51 einsetzen und 25 Mikroliter des maximalen Dopamins von 10 Mikromolar hinzufügen.

Lassen Sie anschließend alle 51 Szintillationsröhrchen 1 Stunde lang in einem Abzug. Geben Sie dann 3 Milliliter Szintillationsflüssigkeit in jedes Szintillationsröhrchen und schütteln Sie es 1 Stunde lang kräftig auf einem Shaker. Um tritiiertes Dopamin in einem Beta-Zähler 1 Minute lang zu zählen, öffnen Sie das Programm und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen. Verwenden Sie für die Proteinbestimmung ein Standard-BCA-Protein-Assay-Kit, um die Proteinkonzentrationen der Synaptosomen für Anpassungen zu bestimmen und die Aufnahme zwischen den Proben richtig zu vergleichen.