Markierung von Biocytin-gefüllten Interneuronen in Hippocampusschnitten von Ratten zur Visualisierung

Nehmen Sie fixierte und permeabilisierte Hippocampus-Schnitte von Ratten, die Biocytin-gefüllte Interneurone mit inaktivierten endogenen Peroxidasen enthalten.

Fügen Sie Avidin-Biotin-Komplexe (ABC) hinzu, die Meerrettichperoxidase (HRP) enthalten, und inkubieren Sie, damit das Avidin an Biocytin binden kann.

Ungebundenes ABC abwaschen.

Fügen Sie eine Mischung aus chromogenem Substrat und Metallverstärker hinzu und inkubieren Sie.

Führen Sie Wasserstoffperoxid ein, um das HRP zu aktivieren, das das Substrat oxidiert und einen dunklen Niederschlag bildet, während der Enhancer den Kontrast verbessert.

Übertragen Sie die Scheiben auf Filterpapier und entfernen Sie überschüssigen Puffer. Mit Osmiumtetroxid behandeln, um den Kontrast zu verstärken.

Legen Sie die Scheiben auf eine Folie und montieren Sie sie. Entwässern Sie sie mit steigenden Ethanolkonzentrationen.

Die Scheiben in absolutem Ethanol und Propylenoxid waschen.

Füge Harz hinzu, um das Gewebe zu infiltrieren.

Legen Sie die Scheiben in eine Planchette und erhitzen Sie sie, um das Harz zu polymerisieren. Übertragen Sie die Scheiben auf einen Objektträger, platzieren Sie ein Deckglas und verfestigen Sie das Harz.

Visualisieren Sie mit Hilfe der Lichtmikroskopie die dunkel gefärbten, mit Biocytin gefüllten Interneuronen.

Legen Sie die Schnitte in ein sauberes Glasfläschchen, das PBS enthält. Führen Sie die Avidin HRP-Reaktion durch, indem Sie zuerst die Abschnitte im Avidin Biotin Komplex oder ABC mindestens zwei Stunden lang inkubieren, um das HRP-Reaktionsprodukt zu amplifizieren.

Waschen Sie die Abschnitte anschließend 3 Mal 10 Minuten lang mit PBS und dann zweimal 10 Minuten lang mit Tris-Puffer. Nachdem Sie die letzte Spurenpufferwäsche entfernt haben, geben Sie schnell 1 Tropfen 8%ige Nickelchloridlösung in die Diaminobenzidinlösung oder DAB-Lösung. Pipettieren Sie dann die Lösung ein und aus, um sie zu mischen.

Und fügen Sie schnell 1 Milliliter dieser Lösung über die Abschnitte hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte in dieser Lösung 15 Minuten lang. Fügen Sie dann 10 Mikroliter 1%iges Wasserstoffperoxid zur DAB-Lösung hinzu. Lassen Sie die Reaktion im Dunkeln unter ständigem Rühren etwa 1 bis 2 Minuten lang ablaufen, bis die Zellen markiert sind.

Legen Sie in einen Abzug einen kleinen Kreis Filterpapier in eine Petrischale und befeuchten Sie ihn mit PB. Heben Sie die Teile nacheinander mit einem Pinsel aus dem Glasfläschchen und legen Sie sie vorsichtig flach auf das Papier. Decken Sie die Abschnitte mit einem weiteren angefeuchteten Kreis Filterpapier ab. Und entfernen Sie überschüssigen Puffer, indem Sie Seidenpapier vorsichtig mit der Oberfläche berühren.

Tragen Sie 8 oder 9 Tropfen 1 % Osmiumtetroxid in PB auf das obere Papier auf. Decken Sie die Schüssel ab und bewahren Sie sie mindestens 30 Minuten, aber nicht länger als eine Stunde im Abzug auf. Nach dem Spülen, Montieren und Einschieben der Abschnitte durch eine Reihe von Lösungen mit 50 %, 70 %, 95 % und 100 % Alkohol dehydrieren.

Nach dem Dehydratisierungsschritt werden die Abschnitte für ca. 5 Minuten in ein Glasfläschchen mit 100 % Ethanol auf einem Schüttler überführt. Ersetzen Sie die Alkohollösung durch Propylenoxid und waschen Sie sie dreimal 5 Minuten lang. Bewahren Sie nach dem letzten Waschen etwa 2 Milliliter Propylenoxid in der Durchstechflasche auf und fügen Sie Harz im Verhältnis eins zu eins hinzu.

Stellen Sie sicher, dass das Harz aufgelöst ist, und halten Sie die Abschnitte 30 Minuten lang unter ständigem Rühren. Nach 30 Minuten legen Sie jeden Abschnitt mit einem Holzstäbchen in ein mit Epoxidharz enthaltenes Aluminiumschrötchen und inkubieren über Nacht. Legen Sie das Schrötchen am nächsten Tag für ca. 10 Minuten auf eine heiße Platte.

Nehmen Sie dann jeden Abschnitt mit einem Holzstab auf und legen Sie ihn auf eine saubere Folie. Sobald alle Schnitte auf den Objektträger übertragen wurden, betrachten Sie den Objektträger unter einem Präpariermikroskop, um die Ausrichtung der Scheiben zu überprüfen, und legen Sie ein Deckglas über die Schnitte. 48 Stunden bei 56 Grad Celsius im Ofen aushärten.