In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden zur Untersuchung der RNA-Expression in Hirnschnitten von Ratten

Nehmen Sie fixierte Hirnschnitte von einer Ratte mit Serotonin-Syndrom, was zu einer veränderten Serotoninrezeptor-RNA-Synthese in den Neuronen führt.

Dehydrieren Sie das Gewebe mit Alkohol. Tragen Sie eine Vorbehandlungslösung auf, um endogene hydrolysierende Enzyme zu deaktivieren und deren Wechselwirkung mit Nachweisreagenzien zu verhindern.

Mit einem Siedepuffer behandeln, um die fixierungsinduzierten Vernetzungen aufzubrechen und die Ziel-RNAs freizulegen.

Dehydrieren Sie das Gewebe, ziehen Sie eine hydrophobe Barriere und inkubieren Sie sie mit einer Lösung, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Fügen Sie Oligonukleotidsonden hinzu und inkubieren Sie, so dass die Sonden mit den Ziel-RNAs hybridisieren können.

Waschen Sie, um ungebundene Sonden zu entfernen, und inkubieren Sie dann mit Amplifikationsreagenzien, die Vorverstärker-, Verstärker- und enzymkonjugierte Markierungssonden enthalten, die an die Oligonukleotidsonden binden.

Inkubieren Sie mit chromogenen Substraten, die durch die enzymkonjugierten Sonden hydrolysiert werden, wodurch sichtbare Farbe entsteht.

Behandeln Sie mit Xylol, um die Transparenz des Gewebes zu erhöhen, fügen Sie ein Eindeckmedium hinzu und tragen Sie ein Deckglas auf.

Unter dem Mikroskop helfen farbige Flecken im Gewebe, die Expression der Ziel-RNA zu quantifizieren.

Bei diesem Verfahren werden zur Dehydrierung vier Objektträger für Objektträgerboxen entnommen, die im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden. Ordnen Sie die Abschnitte den Tests der ppiB-, dapB- und ht2a-Gene zu. Markieren und beschriften Sie sie mit einem Kugelschreiber.

Tauchen Sie die Objektträger anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 100%igen Alkohol. Trocknen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang im Abzug. Pipettieren Sie zur Vorbehandlung 20 Mikroliter der Vorbehandlung, ein Reagenz in jeden Abschnitt.

Legen Sie die Objektträger auf eine Schiene in einer Feuchtigkeitsschale. Schütteln Sie die Feuchtigkeitsschale auf einem horizontalen Shaker 10 Minuten lang vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Objektträger in ein 1.000-Milliliter-Becherglas, das 450 Milliliter des Reagenzes für die Vorbehandlung 2 enthält.

Anschließend kochen Sie die Objektträger insgesamt fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um die RNA-Struktur wiederherzustellen. Waschen Sie die Objektträger danach zweimal jeweils zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 100%igen Alkohol.

Trocknen Sie die Dias dann fünf Minuten lang im Abzug. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um den ausgewählten Bereich im Gewebeschnitt. Pipettieren Sie anschließend 10 Mikroliter des Vorbehandlungsreagenzes in jeden ausgewählten Bereich, um die Sondenpenetration zu erhöhen, und decken Sie die Feuchtigkeitsschale mit einem Deckel ab.

Stellen Sie dann das Blech in den Hybridisierungsofen, der mit einem horizontalen Schüttler ausgestattet ist. Stellen Sie die Ofentemperatur auf 40 Grad Celsius ein und schütteln Sie das Blech 30 Minuten lang vorsichtig. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal jeweils zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.

Pipettieren Sie in diesem Schritt 10 Mikroliter ppiB-, dapB- oder htr2a-Sonde auf die ausgewählten Bereiche. Decken Sie dann die Feuchtigkeitsschale mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung des Reagenzes zu verhindern. Schütteln Sie die Objektträger auf dem horizontalen Schüttler vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit, während Sie sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Ofen inkubieren.

Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal jeweils zwei Minuten lang mit Waschpuffer. Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal jeweils zwei Minuten lang mit Waschpuffer

Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes 2 auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger danach zweimal jeweils zwei Minuten lang mit Waschpuffer

Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes 3 auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer

Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes 4 auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer

Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes 5 auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Rutschen anschließend zweimal zwei Minuten lang mit Waschpuffer

Pipettieren Sie 10 Mikroliter des Amplifikationsreagenzes 6 auf jeden ausgewählten Bereich. Schütteln Sie die Objektträger und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger dann erneut zweimal mit Waschpuffer für jeweils zwei Minuten.

Pipettieren Sie nun 10 Mikroliter des roten Reagenzes in jeden ausgewählten Bereich. Legen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in die Feuchtigkeitsschale des horizontalen Schüttlers und schütteln Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit. Waschen Sie die Objektträger dann zweimal jeweils 10 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.

Die Dias bei 60 Grad Celsius im Ofen 15 Minuten trocknen. Legen Sie danach die Objektträger für fünf Minuten in Xylol in den Abzug. Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter Einbettmedien auf Xylolbasis auf jede ausgewählte Fläche und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.