Immunfluoreszenzfärbung von Drosophila-Gehirnen für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen

Beginnen wir mit Gehirnen von transgenen Drosophila-Fliegen, die verschiedene Gliazelltypen enthalten, die ein zellspezifisches Rekombinasesystem beherbergen.

Es steuert die Expression eines Zelloberflächenproteins, das mit verschiedenen antigenen Epitopen auf demselben Zelltyp fusioniert ist.

Behandeln Sie das Gewebe mit einem Fixiermittel, um Proteine zu vernetzen und die Gewebearchitektur zu erhalten.

Waschen, um überschüssiges Fixiermittel zu entfernen.

Fügen Sie blockierende Proteine hinzu, um unspezifische Bindungsstellen zu maskieren und die Hintergrundfärbung zu reduzieren.

Inkubieren Sie das Gewebe mit einem primären Antikörpercocktail, der an die verschiedenen Epitope bindet, die auf Gliazellen exprimiert werden.

Waschen, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die an die Primärantikörper binden.

Waschen, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.

Montieren Sie das Gehirn in einem bildgebenden Abstandshalter und legen Sie ein Deckglas an. Der Abstandshalter schafft eine Kammer für das Gewebe, wobei seine dreidimensionale Struktur erhalten bleibt.

Verschiedene Zellen des gleichen Gliatyps, die mit unterschiedlichen Fluorophor-konjugierten Antikörpern markiert sind, ermöglichen ein Verständnis der Zell-Zell-Interaktionen.

Übertragen Sie die isolierten Gehirne mit einer P10-Pipettenspitze in ein 200-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Fixierlösung. Fassen Sie das Gehirn niemals mit einer Pinzette an. Inkubieren Sie das Gewebe lichtgeschützt. Vermeiden Sie es, das Gehirn während des Lösungstransfers zu aspirieren.

Um das Fixiermittel zu entfernen, verwenden Sie drei oder mehr 15-minütige Wäschen mit Waschlösung. Blockieren Sie dann das Gewebe 30 Minuten oder länger mit einer Blockierungslösung. Ersetzen Sie anschließend die Blockierungslösung durch in Waschlösung verdünnte Primärantikörper und inkubieren Sie das Gehirn über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Um die primären Antikörper zu entfernen, verwenden Sie drei 1-stündige Waschgänge in Waschlösung. Fügen Sie als Nächstes sekundäre Fluorophor-konjugierte Antikörper in Waschlösung hinzu und inkubieren Sie das Gehirn über Nacht bei 4 Grad Celsius oder 4 Stunden lang bei Raumtemperatur. Um die ungebundenen Antikörper vollständig abzuwaschen, verwenden Sie drei 1-stündige Wäschen in Waschlösung, gefolgt von einer längeren Wäsche mit PBS.

Besteigen Sie dann die Gehirne. Bereiten Sie zwei Deckgläser mit einem Abstandshalter für die Bildgebung vor. Tragen Sie in den Abstandshalter und auf das zusätzliche Deckglas 10 Mikroliter Eindeckmittel mit einem Lichtschutzmittel auf. Übertragen Sie dann mit einer P10-Pipette das Gehirn auf das Deckglas und legen Sie es zusammen mit etwas PBS neben das Medium. Lassen Sie das Taschentuch nicht austrocknen.

Bewegen Sie nun das Gehirn vorsichtig mit der Pipette in das Einbettmedium. Und schließlich bewegen Sie sie auf das Medium im Abstandshalter und ordnen Sie sie mit einer Pinzette an. Entfernen Sie dann die Klebefolie auf den Abstandshaltern und bringen Sie ein Deckglas an. Sichern Sie das Deckglas mit etwas Druck mit einer Pinzette und fahren Sie sofort mit der Bildgebung fort.