Beurteilung der Glukoseaufnahme in den Motoneuronen von Drosophila-Larven mit hochreguliertem Glukosestoffwechsel

Die Kontrolllarven und die mutierte Drosophila-Larve werden in getrennte Schalen gegeben, die einen glukosefreien Puffer enthalten.

Präparieren Sie die Larven, um innere Organe zu entfernen und das Zentralnervensystem oder ZNS freizulegen.

Das ZNS umfasst einen ventralen Nervenstrang, in dem sich Motoneuronen befinden. In den mutierten Larven zeigen diese Neuronen einen hochregulierten Glukosestoffwechsel

.

Motoneuronen in beiden Gruppen exprimieren intrazelluläre Glukosesensoren, die Donor- und Akzeptorfluorophore enthalten.

Positionieren Sie die Larven unter einem konfokalen Mikroskop. Bei der Anregung emittiert das Donorfluorophor Fluoreszenz.

Lokalisieren Sie die Motoneuronen anhand dieser Fluoreszenz.

Ersetzen Sie den Puffer durch eine mit Glukose angereicherte Lösung.

Glukose dringt in die Neuronen ein, bindet an die Sensoren und löst eine Konformationsänderung aus, die die beiden Fluorophore in die Nähe bringt.

Bei der Anregung absorbiert der Akzeptor die vom Donor emittierte Energie, die als Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer oder FRET bezeichnet wird, und emittiert Fluoreszenz.

Das FRET-Signal korreliert mit der Glukoseaufnahme. Eine höhere Intensität des Akzeptorsignals in den mutierten Larven im Vergleich zur Kontrolle deutet auf einen hochregulierten Glukosestoffwechsel hin.

Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das bildgebende Mikroskop und die Laser ein. Sammle dann eine wandernde Larve des dritten Stadiums. Spülen Sie es mit doppelt destilliertem Wasser ab und geben Sie es in einen Tropfen HL3-Puffer auf eine zuvor vorbereitete, mit Elastomer ausgekleidete Schale.

Als nächstes verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop eine Pinzette, um das vordere und hintere Ende der Larve mit der Rückenseite nach oben festzustecken, indem Sie die Larve vorsichtig mit Insektennadeln in Längsrichtung dehnen. Machen Sie mit einer abgewinkelten Irisschere einen Schnitt direkt über der hinteren Nadel. Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt vom Schnitt zum vorderen Ende der Larve.

Entfernen Sie nach Zugabe einiger Tropfen HL3-Puffer bei Bedarf die Luftröhre und den Rest der Schwimmorgane, ohne das Zentralnervensystem zu stören. Stecken Sie dann die Lappen fest und dehnen Sie die Körperwand, um das zentrale Nervensystem freizulegen, während das neuromuskuläre System intakt bleibt.

Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse. Wählen Sie dann den 405-Nanometer-Laser aus, um den CFP anzuregen. Optimieren Sie als Nächstes die Erfassungsparameter, wie z. B. Scangeschwindigkeit, Durchschnitt, Objektiv, Zoom-Lochblendengröße und räumliche Auflösung. Passen Sie die Verstärkung so an, dass sich das Signal im optimalen Dynamikbereich befindet, und verwenden Sie für alle Genotypen die gleichen Parameter.

Um Motoneuronen im ventralen Nervenstrang abzubilden, platzieren Sie die Silikonschale mit der präparierten Probe unter der Linse und senken Sie die Linse so, dass sie mit der Trehalose-Saccharose HL3 in Kontakt kommt. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist, und fügen Sie bei Bedarf weiteren Puffer hinzu.

Als nächstes wählen Sie mit den CFP- und FRET-Kanälen manuell eine optische Auswahl aus, die aus mindestens 6 fokussierten Motoneuronen besteht, die sich entlang der Mittellinie des ventralen Nervenstrangs befinden. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden oder 10 Minuten Bilder auf. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.

Für die Glukosestimulation entfernen Sie die Trehalose-Saccharose, die HL3-Puffer enthält, mit einer Pasteur-Pipette und fügen Sie 5 millimolare Glukose-ergänzte HL3-Puffer hinzu, ohne den ventralen Nervenstrang zu bewegen. Nehmen Sie dann weitere 10 Minuten lang alle 10 Sekunden Bilder auf.

Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar. Speichern Sie die Bilder als Punkt-Czi-Dateien oder einen beliebigen Dateityp, der von der Bildgebungssoftware unterstützt wird, mit einem Dateinamen, der das Datum, den genetischen Hintergrund, die Versuchsbedingungen und die verwendeten Kanäle enthält. Wiederverwendung der Parameter, um alle Genotypen abzubilden.