Aufbereitung eines Mausgehirns für die nachgelagerte Analyse

Nehmen Sie ein frisch entnommenes Mäusegehirn und frieren Sie es in vorgekühltem Isopentan ein, um das Gewebe schnell zu konservieren.

Übertragen Sie als Nächstes das Gehirn mit der Rindeseite nach oben in eine gefrorene Gehirnmatrix, um während des Schneidens eine kalte Umgebung zu erhalten.

Lassen Sie das Gehirn sich auf die Matrixtemperatur einstellen. Richten Sie es in der Matrize entlang der sagittalen und transversalen Nebenhöhlen aus, um symmetrische Schnitte zu gewährleisten.

Führen Sie gekühlte Klingen in das Gehirn ein und stellen Sie sicher, dass sie richtig ausgerichtet sind.

Drücken Sie sie dann gleichmäßig nach unten, um gleichmäßige Gehirnabschnitte zu erhalten.

Entfernen Sie die Klingen mit den Abschnitten und positionieren Sie sie mit der rostralen Seite nach oben auf einer gefrorenen Glasplatte.

Ordnen Sie die Abschnitte von rostral bis kaudal in der richtigen anatomischen Reihenfolge an. Trennen Sie sie nun.

Lokalisieren Sie unter Verwendung einer geeigneten Gehirnreferenz die interessierende Region und entfernen Sie sie aus dem Schnitt.

Übertragen Sie das exzidierte Gewebe zur nachgelagerten Analyse in ein vorgekühltes Fläschchen.

Nach der Entnahme von Gehirnen von euthanasierten adulten CD-1-Wildtyp-Mäusen friert man das Gewebe 60 Sekunden lang entweder in flüssigem Stickstoff oder Isopentan ein, das mit Trockeneis vorgekühlt ist, und lagert es bei -80 Grad Celsius.

Legen Sie 24 Stunden vor dem Präparieren des Gewebes eine saubere Gehirnmatrix auf einen Stapel aufgetauter Gefrierakkus und klemmen Sie die Seiten der Matrix zwischen zwei Gefrierakkus, wobei Sie darauf achten, dass zwischen der Unterseite der Rasierschlitze und der Oberseite der Packungen etwa ein halber Zentimeter bleibt.

Richten Sie eine gefrorene Glasplatte für das Sezieren ein, indem Sie eine isolierte Box bis zu etwa 5 Zentimeter von oben mit Eis füllen. Legen Sie dann eine 2,5 Zentimeter dicke Schicht Trockeneis darauf und decken Sie sie mit schwarzer Plastikfolie ab. Lege eine Glasplatte auf das Plastik und trockne Eis um die Ränder der Platte.

Nehmen Sie die gefrorene Hirnmatrix aus dem Gefrierschrank und setzen Sie die Hirnrindenseite nach oben in die Matrix ein. Lassen Sie das Taschentuch 10 Minuten lang an die Temperatur in der Box angepasst werden, wobei Sie den Deckel während dieser Zeit offen halten. Verwenden Sie eine kalte Pinzette, um die Position des Gehirns in der Matrix so anzupassen, dass der Sinus sagittalis und der Sinus transversum mit den senkrechten Rillen des Blocks übereinstimmen.

Sobald das Gehirn in Position ist, platzieren Sie eine gekühlte Rasierklinge in der Nähe seiner Mitte und drücken Sie sie etwa 1 Millimeter in das Gewebe. Legen Sie als Nächstes eine gekühlte Klinge an jedes Ende des Gehirns und drücken Sie sie ganz nach unten in die Matrix. Beginnen Sie dann, gekühlte Klingen am rostralen Ende hinzuzufügen, legen Sie sie nacheinander in die Schlitze und drücken Sie sie vorsichtig 1 Millimeter in das Gewebe. Fügen Sie die Klingen in Abständen von 1 Millimeter hinzu und arbeiten Sie sich zum kaudalen Ende hin.

Wenn alle Klingen an Ort und Stelle sind, drücken Sie mit den Fingern, der Handfläche oder einem stumpfen Gegenstand auf die Oberseite und bewegen Sie sie langsam von einer Seite zur anderen, um sie durch das Gewebe zu bewegen. Sobald die Klingen den Boden der Schlitze erreicht haben, greife jede Seite der Klingengruppe und befreie sie von der Matrix, indem du sie hin und her schaukelst.

Nachdem Sie die Klingengruppe befreit haben, legen Sie sie mit der rostralen Seite nach oben auf die Glasplatte und legen Sie Trockeneis neben oder auf den Stapel, um die Proben weiter einzufrieren und die Trennung zu erleichtern. Platzieren Sie dann den Stapel mit den scharfen Kanten nach unten und trennen Sie die Klingen, indem Sie den Stapel zwischen Daumen und Fingern verschieben.

Richten Sie den Abschnitt auf den Glasplatten von rostral nach kaudal aus und trennen Sie das Gewebe von den Klingen, indem Sie sie zwischen den Fingern biegen oder mit einer zweiten gekühlten Klinge trennen. Manchmal kann Gewebe an beiden Seiten einer Klinge haften bleiben, und es muss darauf geachtet werden, dass die Ausrichtung von rostral zu kaudal erhalten bleibt.

Bevor Sie mit der Sektion beginnen, öffnen Sie den Allen Mouse Brain Atlas oder eine andere Referenz und suchen Sie die Orientierungspunkte, die zur Identifizierung von Interessengebieten erforderlich sind. Verwenden Sie eine gekühlte Pinzette oder Klinge, um den Abschnitt zu wenden, und stellen Sie sicher, dass der interessierende Bereich im gesamten Abschnitt konsistent ist.

Schneiden Sie mit einem sauberen Skalpell oder Stanzer in den Abschnitt, drücken Sie das Metall sanft, aber fest in das Gewebe und schaukeln Sie es hin und her, um den Schnitt zu machen. Nachdem Sie die interessierende Region geerntet haben, geben Sie sie in beschriftete vorgekühlte 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bei -80 Grad Celsius.