Beurteilung des Palmitoylierungszustands von Zellmembranproteinen aus Hirngewebe der Maus

Nehmen Sie Zellmembranproteine aus dem Gehirngewebe der Maus.

Diese Proteine weisen eine posttranslationale Modifikation mit Palmitoylgruppen, einer Fettsäure, auf, die an Cysteinreste gebunden ist.

Fügen Sie einen Reduktionspuffer hinzu und inkubieren Sie bei hoher Temperatur, um die Bindungen zwischen nicht palmitoylierten Cysteinen aufzubrechen und sie freizulegen.

Inkubieren Sie mit einem blockierenden Reagenz, das an die freiliegenden Cysteine bindet, so dass nur die palmitoylierten Cysteine reaktiv bleiben.

Übertragen Sie die Lösung, mischen Sie sie mit Chloroform, Methanol und deionisiertem Wasser, zentrifugieren Sie sie, um die Proteine auszufällen, und entfernen Sie alle Verunreinigungen. Fügen Sie als Nächstes Methanol und Zentrifuge hinzu und entsorgen Sie alle verbleibenden Verunreinigungen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, beschallen Sie, um das Pellet zu lösen, zentrifugieren Sie es und entfernen Sie unlösliche Materialien.

Tragen Sie ein Spaltreagenz auf, um die Palmitoylgruppen von den palmitoylierten Cysteinen zu entfernen.

Wiederholen Sie die Chloroform-Methanol-Fällung und entfernen Sie alle Verunreinigungen.

Inkubieren Sie mit einem Polymer, das an nicht blockierte Cysteine bindet und so zur Identifizierung der palmitoylierten Proteine beiträgt.

Wiederholen Sie die Chloroform-Methanol-Fällung und entfernen Sie alle ungebundenen Polymere.

Resuspendieren Sie das Pellet zur weiteren Analyse des Palmitoylierungszustands der isolierten Proteine.

Brechen Sie zunächst die Disulfidbindungen auf, indem Sie das gelöste Protein in 25 Mikrolitern TCEP 60 Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubieren. Blockieren Sie dann freie Cysteine, indem Sie die Lösung drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 12,5 Mikrolitern der Stammlösung von NEM inkubieren.

Als nächstes beginnen Sie mit dem Prozess der Chloroform-Methanol-Fällung. Übertragen Sie die Proteinlösung aus dem 1,5-Milliliter-Röhrchen in ein Polypropylen- oder Glasröhrchen, das in einem schwingenden Schaufelrotor bei bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann. 2 Milliliter Methanol zugeben und kurz vortexen. 1 Milliliter Chloroform zugeben und kurz vortexen. Dann 1,5 Milliliter entionisiertes Wasser hinzugeben und nochmals kurz vortexen.

Falls erforderlich, drehen Sie das Rohr um, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 G und 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor. Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase der Lösung und entsorgen Sie sie in einem Röhrchen. Fügen Sie 1,5 Milliliter Methanol hinzu. Mischen Sie vorsichtig, aber gründlich durch vorsichtiges Umdrehen der Tube, wobei darauf zu achten ist, dass der undurchsichtige Proteinpfannkuchen nicht fragmentiert wird.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.000 G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor. Entfernen Sie mit einer serologischen Glaspipette so viel wie möglich von der oberen Phase der Lösung, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 1 Milliliter Methanol ab und lassen Sie es mindestens 10 Minuten an der Luft trocknen.

Nachdem die Chloroform-Methanol-Fällung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit der Spaltung der Palmitoylthioester-Bindungen, indem Sie den Proteinniederschlag in 125 Mikrolitern Puffer A resuspendieren. Beschallen Sie das Röhrchen kurz und zentrifugieren Sie es dann 10 Minuten lang bei 13.000 G oder höher und 25 Grad Celsius, um unlösliches Material zu entfernen.

Übertragen Sie das lösliche Protein in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 375 Mikroliter Puffer H oder Puffer T hinzu. Nachdem die Proben 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, ist die Chloroform-Methanol-Fällung zu wiederholen. Um mPEG zu ungeschützten Cysteinen hinzuzufügen, beginnen Sie mit der Resuspendierung des Pellets in 100 Mikrolitern Puffer A, der 10 millimolare TCEP enthält.

Übertragen Sie dann die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. 25 Mikroliter mPEG 5k Stammlösung zugeben und durch Pipettieren mischen. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit einer End-over-End-Rotation. Nach 60 Minuten Inkubation entfernen Sie nicht eingebautes mPEG 5k, indem Sie erneut eine Chloroform-Methanol-Fällung durchführen.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei mehr als dem 13.000-fachen G und 25 Grad Celsius. Die obere Phase wie zuvor vorsichtig entfernen, dabei den dickflüssigen Pfannkuchen aussparen. 1 Milliliter Methanol zugeben und vorsichtig, aber gründlich mischen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei mehr als dem 13.000-fachen G und 25 Grad Celsius.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 Milliliter Methanol aus. Auch hier wird 10 Minuten lang bei mehr als dem 13.000-fachen G und 25 Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Trocknen an der Luft wird das Pellet in 50 Mikrolitern Puffer A ohne TCEP oder Reduktionsmittel resuspendiert.