Beurteilung des Palmitoylierungszustands von Zellmembranproteinen aus Hirngewebe der Maus

Nehmen Sie Zellmembranproteine aus dem Gehirngewebe der Maus.

Diese Proteine weisen eine posttranslationale Modifikation mit Palmitoylgruppen, einer Fettsäure, auf, die an Cysteinreste gebunden ist.

Fügen Sie einen Reduktionspuffer hinzu und inkubieren Sie bei hoher Temperatur, um die Bindungen zwischen nicht palmitoylierten Cysteinen aufzubrechen und sie freizulegen.

Inkubieren Sie mit einem blockierenden Reagenz, das an die freiliegenden Cysteine bindet, so dass nur die palmitoylierten Cysteine reaktiv bleiben.

Übertragen Sie die Lösung, mischen Sie sie mit Chloroform, Methanol und deionisiertem Wasser, zentrifugieren Sie sie, um die Proteine auszufällen, und entfernen Sie alle Verunreinigungen. Fügen Sie als Nächstes Methanol und Zentrifuge hinzu und entsorgen Sie alle verbleibenden Verunreinigungen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, beschallen Sie, um das Pellet zu lösen, zentrifugieren Sie es und entfernen Sie unlösliche Materialien.

Tragen Sie ein Spaltreagenz auf, um die Palmitoylgruppen von den palmitoylierten Cysteinen zu entfernen.

Wiederholen Sie die Chloroform-Methanol-Fällung und entfernen Sie alle Verunreinigungen.

Inkubieren Sie mit einem Polymer, das an nicht blockierte