Nachweis von Histonmodifikationen in Hefezellen mit neurodegenerativer Proteinüberexpression

Beginne mit einer Suspension von Hefezellen, die Proteine überexprimieren, die mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden.

Dieses überexprimierte Protein ist verantwortlich für Modifikationen in den DNA-verpackenden Proteinen oder Histonen mit chemischen Anteilen.

Natriumhydroxid und Beta-Mercaptoethanol hinzufügen und dann auf Eis inkubieren.

Natriumhydroxid und Beta-Mercaptoethanol lysieren die Zellen und setzen die intrazellulären Proteine, einschließlich Histone, frei.

Zentrifugen Sie das Lysat, um die Proteine zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand.

Füge dem Proteinpellet einen Ladefarbstoff hinzu und erhitze es, um es zu denaturieren.

Laden Sie diese denaturierten Proteine und einen Proteinmarker auf das Gel und die Elektrophorese, um sie nach Größe zu trennen.

Übertragen Sie die Proteine elektroauf eine Membran, waschen Sie sie und fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Fügt primäre Antikörper hinzu, die spezifisch an modifizierte Histone binden.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen und mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern zu inkubieren, die an die primären Antikörper binden.

Eine ausgeprägte Fluoresz