Nachweis von neurodegenerativem Protein α-Synuclein mittels ELISA

Beginnen Sie mit dem Hirngewebe einer transgenen Maus, die mutiertes α-Synuclein überexprimiert, ein fehlgefaltetes neuronales Protein, das mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird, und in einen Puffer mit hohem Salzgehalt eingetaucht ist.

Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem großen Stößel, gefolgt von einem kleinen Stößel, um das Gewebe aufzubrechen und intrazelluläre Proteine, einschließlich α-Synuclein, freizusetzen.

Das Homogenat in ein Röhrchen geben und zentrifugieren. Sammeln Sie den proteinhaltigen Überstand und verdünnen Sie ihn mit einem Puffer.

Geben Sie diesen Überstand in eine mit α-Synuclein-spezifischen Antikörpern beschichtete Mikroplatte, die mit einem Blockierungsmittel vorbehandelt wurde, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.

Unter Rühren inkubieren, so dass normales und mutiertes α-Synuclein binden können.

Waschen Sie die Platte, fügen Sie dann Nachweisantikörper hinzu, die spezifisch für mutiertes α-Synuclein sind, und inkubieren Sie unter Rühren.

Erneut waschen und enzymgebundene Antikörper hinzufügen, gefolgt von einer Inkubation unter Rühren.

Substrat zugeben und im Dunkeln unter Rühren inkubieren. Das Substrat reagiert mit dem Enzym und erzeugt eine Farbveränderung.

Stoppen Sie die Reaktion mit einer Säure und messen Sie die Absorption, um mutiertes α-Synuclein zu quantifizieren.

Um Gehirnhomogenate herzustellen, fügen Sie den präparierten Hirnregionen ein ausreichendes Volumen HS-Puffer hinzu, um einen erwarteten prozentualen Homogenat zu erreichen, wie in der folgenden Tabelle gezeigt. Gießen Sie mit einer Gewebemühle, die aus einem Borosilikatglasrohr und zwei Stößeln, A und B, besteht, eine Gehirnregion, die zerkleinert werden soll, in das Rohr. Und dann mit Stößel A das Gewebe 10 Mal homogenisieren, um es zu dissoziieren.

Dann auf Stößel B umschalten und weitere 20 Mal homogenisieren. Übertragen Sie das Homogenat mit einer Transferpipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und wiederholen Sie die Homogenisierung mit den restlichen Gehirnproben. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Und dann sammeln Sie die Überstände und teilen Sie sie in 200-Mikroliter-Aliquoten auf.

Mit 100 Mikrolitern der Antikörper-Beschichtungslösung beschichten Sie die Vertiefungen der 96-Well-Mikrotiterplatten und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Geben Sie am nächsten Tag 300 Mikroliter PBST in die Vertiefungen und verwenden Sie eine Tellerwaschmaschine, um die Platten fünfmal zu waschen. Während Sie bei Raumtemperatur arbeiten, geben Sie in Zukunft 200 Mikroliter T20 PBS-Blockierungspuffer in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platten eine Stunde lang bei 150 U/min, bevor Sie die Platten mit PBST fünfmal waschen.

Unter Verwendung von PBST, 1% BSA, verdünnen Sie die Gehirnhomogenate gemäß den hier aufgeführten Richtlinien. Und geben Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung. Dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 150 U/min inkubieren, bevor die Platten mit PBST fünfmal gewaschen werden.

Nach der letzten Wäsche fügen Sie die erforderlichen Alpha-Synuclein-Nachweisantikörper hinzu, die in PBST und 1 % BSA verdünnt sind, wie in Tabelle zwei des Textprotokolls aufgeführt. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur und 150 U/min, bevor Sie die Platten wie zuvor fünfmal waschen.

Als nächstes fügen Sie entweder Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IGG-HRP-Konjugate hinzu, verdünnt auf 1 bis 8.000 in PBST, 1 % BSA. Und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 150 U/min, bevor Sie die Platten fünfmal waschen. Geben Sie dann 100 Mikroliter TMB-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 150 U/min im Dunkeln. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter einer normalen Salzsäure pro Vertiefung hinzufügen. Verwenden Sie dann einen Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 450 Nanometern zu messen.