Name: Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Hydroxyapatit-Chromatographie zur Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngiger DNA und RNA aus ökologischen viralen Gemeinschaften. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung viraler Diversität und Funktionalität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vom Office of Science (BER), US Department of Energy, Cooperative Agreement nicht unterstützt. De-FC02-02ER63453, die National Science Foundation Mikrobielle Genome Sequencing Program (Auszeichnung Zahlen 0626826 und 0731916). Wir danken John Glass für seine technische Kompetenz und Beratung und K. Eric Wommack für seine Unterstützung bei der Umwelt-Probenentnahme.

1. Herstellung von Lösungen Vor der Durchführung Hydroxyapatit-Chromatographie, muss Phosphatpuffer hergestellt werden und die Hydroxyapatit muss richtig hydratisiert. <ol><li> 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8: In einem 1L Flasche auflösen 119.98g Natriumphosphat einbasigen in 1L steril, DEPC-behandeltem H 2 O. Bereiten Sie eine 1M Natriumdihydrogenphosphat-Lösung in einem 1L Flasche durch Auflösen von 141.96g von Natriumdihydrogenphosphat in 1L steril, DEPC-behandeltem H 2 O. Kombinieren Sie die Mono-und Di-Lösungen mit einem Verhältnis von 1:1. Küvette auf einer Rührplatte und mischen mit einem magnetischen Rührstab. Der pH-Wert auf 6,8 durch Zugabe von Natronlauge (zur pH-Erhöhung) oder Phosphorsäure (zur pH-Abnahme). </li><li> 0,12 M Phosphatpuffer: In einem 500 ml-Kolben, kombinieren 30ml 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8, 2,5 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 ml 0,5 M EDTA. Add sterile, DEPC-behandeltem H2O auf ein Volumen von 225ml. Der pH-Wert auf 6,8. Add sterile, DEPC-behandeltem H2O auf 250ml. Autoclave. </li><li> 0,18 M Phosphatpuffer: In einem 500 ml-Kolben, kombinieren 45ml 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8, 2,5 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 ml 0,5 M EDTA. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf ein Volumen von 225ml. Der pH-Wert auf 6,8. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf 250ml. Autoclave. </li><li> 0,20 M Phosphatpuffer: In einem 500 ml-Kolben, kombinieren 50ml 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8, 2,5 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 ml 0,5 M EDTA. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf ein Volumen von 225ml. Der pH-Wert auf 6,8. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf 250ml. Autoclave. </li><li> 0.40 M Phosphatpuffer: in einer 500ml Flasche, kombinieren 100ml 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8, 2,5 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 ml 0,5 M EDTA. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf ein Volumen von 225ml. Der pH-Wert auf 6,8. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf 250ml. Autoclave. </li><li> "1,00 M Phosphat-Puffer" (tatsächliche Konzentration von Phosphat in dieser Lösung ist 0,91 M): In einem 500 ml-Kolben, kombinieren 30ml 1M Phosphat-Lösung, pH 6,8, 2,5 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 5 ml 0,5 M EDTA. Add sterile, DEPC-behandeltem H2O auf ein Volumen von 225ml. Der pH-Wert auf 6,8. Add sterile, DEPC-behandeltem H 2 O auf 250ml. Autoclave. </li><li> Hydroxyapatit Hydratation: Gewicht aus 1g aus Hydroxylapatit und hinzufügen, um eine 50ml Tube. Add 6ml von 0,12 M Phosphat-Puffer auf die Hydroxyapatit und umkehren zu mischen. Vor dem Einsatz bringen Temperatur auf 60 ° C und gründlich mischen. Shop für längere Zeit bei 4 ° C. </li><li> Vor dem Gebrauch Gleichgewicht aller Phosphat-Puffer und hydratisiert Hydroxyapatit bei 60 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von Econo-Column <ol><li> Absperrhahn schließen. Spülen Spalte mehrmals mit deionisiertem H 2 O Durch wiederholtes Umdrehen der Säule und Dekantieren. </li><li> Entfernen Sie den Hahn aus der Econo-Säule und der Säule Autoklaven zu sterilisieren. </li><li> Ersetzen und schließen Hahn. 1ml von Sigmacote die sterile Econo-Säule und Mantel aller Glasflächen. Öffnen Sie den Wasserhahn und dekantieren. </li><li> Befestigen Sie die Spalte, um einen zirkulierenden Wasserbad und eingestellte Temperatur auf 60 ° C. Um einsure den geringsten Wärmeverlust über die Säule das Einwickeln der Spalte in einer isolierenden Mittel wie Aluminiumfolie oder Schaum Rohrisolierung wird empfohlen. </li><li> Spülen Sie die Econo-Säule zweimal mit sterilem, RNase-freien H 2 O dann zweimal mit sterilem, RNase-frei 0,12 M Phosphatpuffer. </li></ol> 3. Hydroxypaptite Chromatographie <ol><li> Sicherstellen, dass der Hahn geschlossen ist, langsam zugeben 2ml vorbereiteten, resuspendiert Hydroxyapatit an der Unterseite des Econo-Säule mit einer sterilen 2 ml serologischen Pipette. </li><li> Lassen Sie die Hydroxylapatit unter der Schwerkraft für 30 Minuten absetzen. </li><li> Abfluss-Puffer aus der Säule und in der Nähe Hahn. Kombinieren Nukleinsäuren mit 0,12 M Phosphat-Puffer in einem Endvolumen von 500 ul und Inkubieren bei 60 ° C für 10 Minuten in einem Heizblock oder Wasserbad. </li><li> Schnell gelten Nukleinsäuren in 0,12 M Phosphat-Puffer auf die Hydroxyapatit mit einem 2ml serologischen Pipette darf dabei nicht um die Spalte zu stören vorbereitet. </li><li> Lassen Sie die Nukleinsäuren an das Hydroxyapatit für 30 Minuten zu binden. </li><li> Legen Sie eine 15ml Tube unter der Spalte, öffnen Sie den Hahn und sammelt die ersten Probe mit ssDNA. Absperrhahn schließen. </li><li> Add 6ml von 0,12 M Phosphat-Puffer auf die Hydroxyapatit darf dabei nicht um die Spalte zu stören, öffnen Sie den Hahn, und sammeln Einzelstrang-DNA in der 15ml Tube aus dem vorherigen Schritt. Absperrhahn schließen. </li><li> Add 1 Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:25:1 v / v / v) Lösung für das Rohr, kräftig mischen und zentrifugieren bei 3500 xg für 15 Minuten. Überstand mit ssDNA zu einem neuen 15ml Tube. </li><li> Wiederholen 3,76 und 3,87 mit 6ml von 0,20 M Phosphat-Puffer, um eLaute und reinigen RNA aus der Säule achten Sie darauf, ein neues 15ml Tube für die Sammlung verwenden. </li><li> Wiederholen 3,76 und 3,87 mit 6ml von 0,40 M Phosphat-Puffer zu eluieren und zu reinigen dsDNA aus der Spalte achten Sie darauf, ein neues 15ml Tube für die Sammlung verwenden. </li><li> Wiederholen 3,76 und 3,87 mit 6ml von 1,00 M Phosphat-Puffer auf die Säule der verbleibenden dsDNA achten Sie darauf, ein neues 15ml Tube für die Sammlung verwenden Streifen. </li></ol> 4. Entsalzung Nukleinsäure-Proben <ol><li> Transfer-4-5 ml Probe an einen Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Gerät mit einer 30.000 Molekulargewicht off Ultracel Membran geschnitten ausgestattet. </li><li> Konzentrieren Probe &lt;500μl durch Spinnen bei 6.000 xg, 30 ° C, 5 Minuten (oder bis konzentrierten Volumen erreicht ist) in einem Festwinkelrotor. Entsorgen Sie durchströmen. </li><li> Fügen Sie den Rest der Probe (n) der Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Gerät und bringen die Lautstärke von bis zu 4-5ml mit RNase frei 1X TE-Puffer. </li><li> Konzentrieren Probe &lt;500μl durch Spinnen bei 6.000 xg, 30 ° C, 5 Minuten (oder bis konzentrierten Volumen erreicht ist) in einem Festwinkelrotor. Entsorgen Sie durchströmen. </li><li> Add 4-5 ml RNase frei 1X TE-Puffer auf die Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Gerät. Konzentrieren Probe &lt;500μl durch Zentrifugation bei 6.000 xg, 30 ° C, 5 Minuten (oder bis konzentrierten Volumen erreicht ist) in einem Festwinkelrotor. Entsorgen Sie durchströmen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.5 eine zusätzliche 5-mal vollständig entsalzt Nukleinsäureprobe (s). </li><li> Restlichen Probe (n) in ein steriles 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen. Add 1:10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 7,0, zwei Bände mit 100% Ethanol und 1μl der Glycoblue. Gut mischen durch Vortexen. </li><li> Zentrifuge bei 28.000 xg, 4 ° C, 60 Minuten. Dekantieren darf dabei nicht das Pellet stören. Fügen Sie 300μl 70% Ethanol. Spin bei 28.000 xg, Raumtemperatur für 10 Minuten. Dekantieren, trocken und resuspendieren jeder Fraktion in einem geeigneten Volumen RNase-freiem TE-Puffer. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 fasst die Methoden für den Einsatz Hydroxyapatit-Chromatographie zur Fraktionierung ssDNA, dsDNA und RNA Nukleinsäuren aus einer gemischten virale Assemblage vorgestellt. Diese Methode nutzt die Ladungs-Wechselwirkung zwischen den negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäuren und die positiv geladenen Ca 2 +-Ionen in der Hydroxylapatit und ermöglicht die effiziente Fraktionierung von Nukleinsäure-Subtypen (ssDNA, dsDNA und RNA) mit steigender Phosphat-Puffer-Konzentrationen 12. Die Hydroxyapatit Fraktionierung von einem in vitro-"Community" bekannt ssDNA (M13mp18), dsDNA (Lambda) und RNA (MS2 und phi6) viralen Genomen ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Nukleinsäuren wurden in gleichen Konzentrationen kombiniert, angewandt auf die Hydroxyapatit-Säule und eluiert mit einer zunehmenden Konzentration von Phosphat-Puffer. Jeder Nukleinsäure-Subtyp eluiert unabhängig von den anderen mit weniger als 9% von einem Bruchteil-over zum nächsten zu befördern. Die Anwendung dieser Technik, um Nukleinsäuren aus einer viralen Gemeinde aus der Chesapeake Bay gesammelt isoliert ist in Abbildung 3 dargestellt. Die gesamte Nukleinsäure-Ausbeute von gereinigten Viren isoliert, um die Hydroxyapatit-Säule aufgetragen wurde. Genomic Material, bestehend aus ssDNA, RNA und dsDNA wurde unabhängig mit 0,12 M, 0,20 M und 0.40M/1.00M Konzentrationen von Phosphat-Puffer bzw. eluiert. Doppelsträngige DNA ist bei Phosphat-Konzentrationen von 0,40 M und 1,00 M eluiert und in diesem Fall dominiert diese virale Community im Vergleich zu ssDNA und RNA-Genotypen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der erwarteten virale Community Zusammensetzung der Meeres-und Mündungs-Umgebungen, in denen die Mehrheit der erzielbare Nukleinsäuren dsDNA 13. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm des Hydroxyapatit-Chromatographie-Verfahren zur Fraktionierung von Nukleinsäuren. Eine Mischung aus ssDNA, dsDNA und RNA in 0,12 M Phosphat-Puffer bereit ist, 60 ° C erhitzt und auf eine Hydroxyapatit-Säule bei konstant 60 ° C gehalten mit einem zirkulierenden Wasserbad. Nukleinsäuren (ssDNA, RNA und dsDNA) sind vom Hydroxyapatit mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-Puffer eluiert. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von American Society of Microbiology reproduziert worden und war ursprünglich in Andrews-Pfannkoch et al featured. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Trennung von bekannten viralen Nukleinsäuren mittels Hydroxyapatit-Chromatographie. Equal Konzentrationen von M13mp18 ssDNA, MS2 ssRNA, phi6 dsRNA und Lambda-dsDNA (Spuren 2-5, jeweils) wurden vereinigt (Spur 6) und auf eine Hydroxyapatit-Säule. Single-DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) und dsDNA (Lambda) waren unabhängig von der Hydroxyapatit-Säule mit 0,12 M (Spur 8), 0,18 M (Spur 9) und 0.40M/1.00M (Spur 10) eluiert . Ein 1kb ladder (Bahnen 1, 7) wurde verwendet, um Genomgrößen bestätigen. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von American Society of Microbiology reproduziert worden und war ursprünglich in Andrews-Pfannkoch et al featured. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Separation von viralen Nukleinsäuren aus einer Gemeinde innerhalb der Chesapeake Bay getrennt. Nukleinsäuren wurden isoliert und auf eine Hydroxyapatit-Säule. ssDNA (Spur 0,12 M), RNA (Spur 0,20 M) und dsDNA (Spuren 0.40M/1.0M) wurden unabhängig voneinander eluiert mit Phosphatpuffer Konzentrationen von 0,12 M, 0,20 M und 0.40M/1.00M jeweils. Hallo Messe DNA Ladder (Spur L1) und 1kb Ladder (Spur L2) wurden verwendet, um visuell bestätigen ungefähre Molekulargewicht und die Masse der Nukleinsäuren. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von American Society of Microbiology reproduziert worden und war ursprünglich in Andrews-Pfannkoch et al featured. 2010 12.

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+evolution+of+the+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Popul+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li>
<li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay%3A+Implications+for+Prophage+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li>
<li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li>
<li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Viruses+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li>
<li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li>
<li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li>
<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Hydroxyapatit-Chromatographie-Methodik präsentiert hier ist eine hocheffiziente und robustes Werkzeug für die Fraktionierung von Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen, wenn das Ziel, die gesamte Nukleinsäure Zusammensetzung der Gemeinde-Studie ist. Im Allgemeinen wird ssDNA, RNA und dsDNA aus der Spalte pho-Phosphat-Puffer-Konzentrationen von mehr als etwa ~ 0und 0,40 M bzw. eluieren. Allerdings kann jeder Zubereitung von Hydroxyapatit haben eine etwas andere Zusammensetzung und Elutionsprofil so ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Material Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Econo-Column </td><td> Bio-Rad </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm ID-Paket / 2 </td></tr><tr><td> Hydroxyapatit </td><td> Bio-Rad </td><td> 130-0520 </td><td> DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td&gt; </tr><tr><td> Sodium Phosphate, Einbasisches </td><td> VWR </td><td> VW1497-01 </td><td> Monohydrate, Crystal 500g </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic </td><td> VWR </td><td> VW1496-01 </td><td> Wasserfrei, Pulver 500g </td></tr><tr><td> DEPC-behandeltem Wasser </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> pH 8,0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serologische pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> Polystyrol, steril </td></tr><tr><td> BD Falcon Zentrifugenröhrchen </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, steril </td></tr><tr><td> Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1 v / v / v) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Kreiselpumpen Geräte </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30-Membran </td></tr><tr><td> 20X TE-Puffer, RNase-frei </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

trennung von einzelstrang-dna, doppelsträngige dna und rna aus ökologischer viral gemeinschaft mit hydroxyapatit-chromatographie

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viren, vor allem Bakteriophagen (Phagen), sind die zahlreichen biologischen Einheiten auf der Erde 1,2. Viren modulieren Wirtszelle Fülle und Vielfalt, um den Kreislauf der Nährstoffe beitragen, zu verändern Wirtszelle Phänotyp, und Einfluss auf die Entwicklung der beiden Wirtszelle und Virus-Communities durch die seitlichen Transfer von Genen 3. Zahlreiche Studien haben die erstaunliche genetische Vielfalt der Viren und ihre funktionelle Potenzial in einer Vielzahl von natürlichen Umgebungen hervorgehoben. Metagenom Techniken wurden verwendet, um die taxonomische Diversität und funktionale Potenzial von komplexen viralen Assemblagen, deren Mitglieder enthalten Einzelstrang-DNA (ssDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und RNA-Genotypen 4-9 studieren. Aktuelle Bibliothek Bau-Protokolle verwendet werden, um Umwelt-DNA-haltigen oder RNA-Viren enthalten Studie erfordern eine erste Nuklease Behandlung zur Entfernung nontargeted Templates 10. Allerdings erfordert ein umfassendes Verständnis des kollektiven Gen Ergänzung des Virus-Community und Viren Vielfalt Wissen aller Mitglieder, unabhängig von Genom Zusammensetzung. Die Fraktionierung des gereinigten Nukleinsäure-Subtypen bietet einen wirksamen Mechanismus, durch die virale Assemblagen, ohne dabei eine Teilmenge der Gemeinde genetische Signatur zu studieren. Hydroxyapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, hat in der Trennung von Nukleinsäuren, sowie Proteine ​​und Mikroben eingesetzt worden, seit den 1960er Jahren 11. Durch die Ausnutzung der Ladungs-Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Ca 2 +-Ionen des Hydroxylapatit und der negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der Nukleinsäure-Subtypen, ist es möglich, bevorzugt eluieren jede Nukleinsäure-Subtyp unabhängig von den anderen. Vor kurzem haben wir diese Strategie, unabhängig fraktionieren die Genome von ssDNA, dsDNA und RNA-Viren enthalten in der Vorbereitung der DNA-Sequenzierung 12 verwendet. Hier stellen wir ein Verfahren zur Fraktionierung und Rückgewinnung von ssDNA, dsDNA und RNA viralen Nukleinsäuren aus gemischten virale Assemblagen mit Hydroxyapatit-Chromatographie.

Wir beschreiben eine effiziente Methode, um Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA-und RNA-Molekülen aus Umwelt-virale Gemeinden zu trennen. Nukleinsäuren sind fraktionierte mit Hydroxyapatit-Chromatographie mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-haltigen Puffer. Diese Methode erlaubt die Isolierung aller viralen Nukleinsäure-Typen aus Umweltproben.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Viren, insbesondere Bakteriophagen (Phagen), sind die zahlreichsten biologischen Einheiten auf der Erde1,2. Viren modulieren die Abundanz und Diversität der Wirtszellen, ...

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Trennung gemischter Virusgesellschaften basierend auf ihrer Nukleinsäurezusammensetzung. Dies ermöglicht die Untersuchung der taxonomischen Diversität und des funktionellen Potenzials komplexer Virusgesellschaften. Hierbei wird Hydroxylapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, zur Trennung von Nukleinsäuren eingesetzt.Zunächst wird eine Hydroxylapatitsäule gepackt und äquilibriert. Anschließend werden gereinigte virale Nukleinsäuren auf die Säule aufgetragen, wobei die Ladungswechselwirkung zwischen den positiv geladenen Calciumionen des Hydroxylapatits und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Nukleinsäure-Subtypen die Bindung der Nukleinsäuren an die Säule bewirkt. Danach werden einzelsträngige DNA-RNA sowie doppelsträngige DNA nacheinander mit unterschiedlichen Konzentrationen von Phosphatpuffer eluiert. Die resultierenden Nukleinsäuren werden anschließend entzuckert und konzentriert, um sie für die Visualisierung, Quantifizierung und Identifizierung mittels DNA-Sequenzierung vorzubereiten. Die Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, dass die Nukleinsäure-Spezies mit weniger als 9 % Übertrag getrennt werden können.Daher ermöglicht

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Wir bieten ein verbessertes Protokoll zur Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus hypersaline mikrobielle Matten. Mikrobielle Zellen sind von der Matte Matrix vor der DNA-Extraktion und Reinigung getrennt. Dies erhöht die Konzentration, Qualität und Größe der DNA. Das Protokoll kann für andere feuerfeste Proben verwendet werden.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Quelle: Dembowski, J. A., et al. Aufreinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viral bedingter und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Isolierung von Protein–virale DNA-Komplexen aus Zellkernen mithilfe der Click-Chemie und der Reinigung mit magnetischen Bäden. Das Protokoll umfasst die Markierung viraler Genome mit alkinmodifizierten Nukleotiden, die Biotinylierung über eine Click-Reaktion und die Bindung an mit Streptavidin beschichtete...

Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur Bewertung der Verfügbarkeit organischer und anorganischer Nährstoffe sowie der Häufigkeit und Struktur von mikrobiellen und viralen Gemeinschaften in abgelegenen Meeresumgebungen.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Beschleunigung der Plasmid-DNA-Extraktion. Durch die Verwendung von maßgeschneiderten 3D-gedruckten Racks, die mit Standardrotoren mit Schaufelplatten kompatibel sind, können Forscher bis zu 48 Rotationssäulen mit Kappen oder bis zu 116 Rotationssäulen ohne Kappen gleichzeitig verarbeiten, was die Handhabungszeit im Vergleich zu manuellen Mikrozentrifugenmethoden deutlich verkürzt.

Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Erfahren Sie die Hydroxyapatit-Chromatographie zur Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngiger DNA und RNA aus ökologischen viralen Gemeinschaften. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung viraler Diversität und Funktionalität.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie (Video) | JoVE Journal

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Weitere Videos entdecken