Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Trennung gemischter Virusgemeinschaften anhand ihrer Nukleinsäurezusammensetzung. Dies ermöglicht die Untersuchung der taxonomischen Diversität und des funktionellen Potenzials komplexer Virusverbünde. Hier wird Hydroxylapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, bei der Trennung von Nukleinsäuren eingesetzt.

Zuerst wird eine Hydroxylapatit-Säule gepackt und äquilibrierte gereinigte virale Nukleinsäuren werden dann auf die Säule aufgebracht, die Ladungswechselwirkung zwischen den positiv geladenen Calciumionen des Hydroxylapatits und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Nukleinsäure-Subtypen bindet die Nukleinsäuren an die Säule Nick. Als nächstes werden einzelsträngige, D-N-A-R-N-A- und doppelsträngige DNA nacheinander mit unterschiedlichen Konzentrationen von Phosphatpuffer angedeutet. Die resultierenden Nukleinsäuren werden dann entsalzt und konzentriert, um sie für die Visualisierung, Quantifizierung und Identifizierung durch DNA-Sequenzierung vorzubereiten. Die Agro-Gelelektrophorese bestätigt, dass die Nukleinsäurespezies mit weniger als 9 % Verschleppung getrennt werden können.

Diese Methode ermöglicht somit die Bewertung der Diversität und Funktionsfähigkeit viraler Gemeinschaften. Hallo, mein Name ist Doug Fro und ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Dr. Shannon Williamson am j Craig Venture Institute. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Trennung von einzelsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA und RNA aus einer Virusansammlung in der Umwelt.

Diese Methode hat Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Behandlung mit dem Zellkern, die entweder auf DNA oder RNA abzielt. Die Hydroxylapatit-Chromatographie ist in der Lage, die gesamte virale Gemeinschaft zu erfassen. Diese Methode ermöglicht es uns, mehrere Fragen im Bereich der Virusökologie zu beantworten.

Wie hoch ist zum Beispiel das gesamte Genkomplement oder die Diversität der viralen Gemeinschaft? Wir dachten zum ersten Mal an diese Methode, als wir die gesamte Rio-Plankton-Ansammlung aus der Chesapeake Bay untersuchen wollten, ohne eine Teilmenge der genetischen Signatur zu opfern. Die für diesen Versuch benötigten Lösungen sollten im Voraus gemäß den Anweisungen in dem beigefügten schriftlichen Protokoll hergestellt werden und umfassen 0,12 molare Phosphatpuffer, 0,20 molare Phosphatpuffer, 0,40 molare Phosphatpuffer und eine molare Phosphatlösung.

Alle bei einem pH-Wert von 6,8 und hydratisiertem Hydroxylapatit am Tag des Experiments, gleichen Sie alle Phosphatpuffer und hydratisierten Hydroxylapatit aus, indem Sie sie in ein 60 Grad Celsius heißes Wasserbad legen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Econo-Säule vorbereiten, die für die Trennung von viralen Nukleinsäuren verwendet wird. Befestigen Sie einen Absperrhahn am Ende der econo-Säule und stellen Sie sicher, dass er geschlossen ist.

Geben Sie mit einer Pipette deionisiertes Wasser in die Säule, setzen Sie dann die Kappe auf die Oberseite der Säule und drehen Sie die Säule wiederholt um, um sie zu spülen. Gießen Sie das Wasser ab und wiederholen Sie diese Wäsche mehrmals. Entfernen Sie anschließend den Absperrhahn aus der Econ-Säule und autoklavieren Sie ihn, um ihn zu sterilisieren.

Der Absperrhahn ist nicht autoklaviert, da er sonst schmilzt. Spülen Sie den Absperrhahn mit dem ionisierten Wasser, dann erneut mit 70%igem Ethanol aus und lassen Sie ihn nach dem Autoklavieren an der Luft trocknen. Setzen Sie den Absperrhahn wieder auf und schließen Sie ihn.

Geben Sie anschließend in einem Abzug einen Milliliter Sigma-Beschichtung auf die Säule und beschichten Sie das Säulenglas, indem Sie die Säule mit einer Rollbewegung umkehren, wie hier gezeigt. Die Beschichtung mit einer Sigma-Beschichtung minimiert das Anhaften der Nukleinsäuren an der Glasoberfläche. Bei der Trennung wurden die Oberflächen eines Salzglases beschichtet.

Den Absperrhahn öffnen und in ein konisches Röhrchen umfüllen. Um die Säule anschließend mit einem zirkulierenden Wasserbad zu verbinden, verwenden Sie zwei Klemmen, um die Säule an einem Ringständer zu befestigen. Befestigen Sie einen Silikonschlauch aus dem zirkulierenden Wasserbad, so dass das Wasser aus dem Wasserbad von unten nach oben fließt.

Stellen Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius ein und starten Sie die Zirkulation. In der Praxis würden die Säule und der Schlauch mit einem Isoliermittel umwickelt, wie z. B. Aluminiumfolie oder Schaumstoffrohrisolierung. Um den Wärmeverlust zu minimieren, wird dieser Schritt hier nicht gezeigt.

Um den Vorgang besser visualisieren zu können, schließen Sie den Absperrhahn. Geben Sie mit einer Pipette 10 Milliliter sterile RNAs freies Wasser hinzu. Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie das Wasser ablaufen.

Nach der zweiten Wäsche erneut waschen. Zweimal mit 10 Millilitern steriler RNAs, freiem 0,12 molaren Phosphatpuffer spülen und zwischen den Wäschen dekantieren. Die Säule ist nun bereit für die Hydroxylapatit-Chromatographie.

Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn der econ Säule geschlossen ist. Geben Sie dann mit einer sterilen serologischen Zwei-Milliliter-Pipette langsam zwei Milliliter vorbereiteten, resuspendierten, rehydrierten Hydroxyappetit auf den Boden der Säule. Setzen Sie die Säulenkappe wieder auf.

Lassen Sie den Hydroxyappetit 30 Minuten lang unter der Schwerkraft zur Ruhe kommen. Diese Methode erfordert Liebe zum Detail. Die Hydroxy-Appetit-Säule arbeitet mit einer Geschwindigkeit von 0,25 bis 0,5 mils pro Minute.

Es ist also sehr wichtig, die Säule genau im Auge zu behalten, damit sie nicht austrocknet. Öffnen Sie nach Ablauf von 30 Minuten den Absperrhahn, um den Puffer in einen Abfallbehälter abzulassen. Schließen Sie den Absperrhahn und entsorgen Sie den Durchfluss.

Kombinieren Sie Nukleinsäuren mit 0,12 molaren Phosphatpuffer in einem Endvolumen von 500 Mikrolitern und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Dadurch werden die Nukleinsäuren auf die Temperatur der Säule ausgeglichen und die Trennung der verschiedenen Nukleinsäurespezies verbessert, indem eventuell vorhandene Sekundärstrukturen entfernt werden. Tragen Sie die Nukleinsäurelösung mit einer serologischen Zwei-Milliliter-Pipette schnell auf den Hydroxyappetit auf und achten Sie darauf, die Säule nicht zu stören.

Sobald die gesamten 500 Mikroliter auf die Säule fließen, kann eine kleine Menge 0,12 molaren Phosphatpuffers auf die Oberseite der Säule gegeben werden, um ein Austrocknen zu verhindern. Lassen Sie die Nukleinsäuren 30 Minuten lang an den Hydroxyappetit binden. Nach der Bindungsinkubation stellen Sie ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen unter die Säule.

Öffnen Sie dann den Absperrhahn und entnehmen Sie die erste 500-Mikroliter-Probe, die einzelsträngige DNA enthält. Sobald 500 Mikroliter gesammelt wurden, schließen Sie den Absperrhahn. Fügen Sie als Nächstes sechs Milliliter 0,12 molaren Phosphatpuffer zum Hydroxyappetit hinzu und achten Sie darauf, die Säule nicht zu stören.

Öffnen Sie dann den Absperrhahn und fahren Sie mit dem Sammeln des Durchflusses fort, der Singulett-Strang-DNA in demselben 15-Milliliter-Röhrchen aus dem vorherigen Schritt enthält. Nachdem etwa sechs Milliliter gesammelt wurden, schließen Sie den Absperrhahn. Geben Sie ein Volumen einer Phenolchloroform-Isoamylalkohollösung in das durch Vortexen kräftig gemischte Röhrchen und zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei 3.500 mal G.

Nach der Zentrifugation enthält das Röhrchen zwei Schichten. Übertragen Sie die obere Toleranzschicht, die den einzelnen DNA-Strang enthält, in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie die Probe bei Raumtemperatur, um RNA zu eluieren und zu reinigen. Geben Sie aus der Säule sechs Milliliter 0,20 molaren Phosphatpuffer hinzu und sammeln Sie die Durchflussdurchgänge, bevor Sie ein neues 15-Milliliter-Röhrchen verwenden. Führen Sie dann eine Phenol-Chloroform-Extraktion durch.

Bei der einzelsträngigen DNA-Probe wiederholen Sie diesen Vorgang mit sechs Millilitern 0,40 molaren Phosphatpuffern, um doppelsträngige DNA aus der Säule zu eluieren und zu reinigen. Schließlich, um die Säule von verbleibender Dublett-strangiger DNA zu befreien. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal.

Diesmal mit sechs Millilitern 1,00 molaren Phosphatpuffer, um die Nukleinsäureproben zu entsalzen. Übertragen Sie vier bis fünf Milliliter jeder Probe in eine anon Ultra Vier-Zentrifugalfiltervorrichtung, die mit einer Ultra-Zellmembran-Konzentratprobe mit einem Molekulargewicht von 30.000 auf weniger als 500 Mikroliter ausgestattet ist, indem Sie sie etwa fünf Minuten lang bei 6.000 GS bei 30 Grad Celsius in einem Rotor mit festem Winkel drehen. Nachdem Sie den Durchfluss verworfen haben, geben Sie den Rest der Proben in den Filter.

Bringen Sie das Volumen auf vier bis fünf Milliliter mit RNAs, die einen XTE-Puffer frei haben. Dann nochmals schleudern, bis ein konzentriertes Volumen erreicht ist. Etwa fünf Minuten nach dem Schleudern geben Sie vier bis fünf Milliliter RNAs, frei einen XTE-Puffer, in den Filter und konzentrieren Sie.

Wiederholen Sie diesen Waschgang erneut und weitere fünf Mal, um die Nukleinsäureproben vollständig zu entsalzen. Sobald die Proben vollständig konzentriert und entsalzt sind, überführen Sie die verbleibenden Nukleinsäureproben in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von einem Zehntel des Volumens Natriumacetat, zwei Volumina 100%igem Ethanol und einem Mikroliter Glykoblau, gut vermischt, durch Vortexen der Zentrifuge gefällt.

Eine 28.000 GS vier Grad Celsius. 60 Minuten bis Kent. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Fügen Sie 300 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu und schleudern Sie es 10 Minuten lang bei 28.000 GS Raumtemperatur, um nicht trocknen zu können, und resuspendieren Sie jede Fraktion in einem geeigneten Volumen an RNAs. Freier TE-Puffer gleiche Konzentrationen der viralen Nukleinsäuren M 13 MP 18, einzelsträngige DNA MS zwei einzelsträngige, RNA FI sechs doppelsträngige, RNA und Lambda doppelsträngige DNA wurden kombiniert und dann mittels Hydroxylapatit-Chromatographie getrennt, wie in diesem Video gezeigt. Gleiche Konzentrationen von M 13, MP, 18, einzelsträngiger DNA, MS zwei, einzelsträngiger, RNA fünf, sechs, doppelsträngiger RNA und doppelsträngiger Lambda-DNA wurden, wie in Spur sechs gezeigt, kombiniert und auf eine Hydroxylapatit-Säule appliziert, wie hier zu sehen.

Einzelsträngige D-N-A-R-N-A und doppelsträngige DNA wurden unabhängig voneinander von der Hydroxylapatit-Säule unter Verwendung von 0,12 molaren, 0,18 molaren, 0,40 molaren und 1,00 molaren Phosphatpuffern angespielt. Eine Ein-KB-Leiter wurde verwendet, um die Genomgrößen zu bestätigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA und RNA mit weniger als 9% Verschleppung von einer Fraktion zur nächsten erfolgreich zu trennen.

Diese Methode wurde auch verwendet, um Nukleinsäuren zu trennen, die aus einer Virusgemeinschaft in der Chesapeake Bay isoliert wurden, wie hier gezeigt. Einzelsträngige D-N-A-R-N-A und doppelsträngige DNA wurden unabhängig voneinander unter Verwendung von Phosphatpufferkonzentrationen von 0,12 molaren, 0,20 molaren und 0,40 molaren bzw. 1,00 molaren DNA-Leiterbahnen mit hoher Masse in Bahn eins und einer KB-Leiter in Bahn zwei verwendet, um das ungefähre Molekulargewicht und die Masse von Nukleinsäuren visuell zu bestätigen, wie hier zu sehen ist. Doppelsträngige DNA war der dominierende Nukleinsäuretyp, der aus dem Verio-Plankton der Chesapeake Bay extrahiert wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nukleinsäuren von einer gemischten Virusansammlung mithilfe der Hydroxylapatit-Chromatographie trennt.

Dies umfasst die Herstellung der Hydroxylapatit-Säule und der Nukleinsäuren, die Trennung und Illusion von Nukleinsäuren unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Phosphatpuffer und Entsalzung sowie die Konzentration der Nukleinsäuren nach der Trennung.