JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:19 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie eine gefriergebrochene Probe von Mäusehirngewebe in einem Puffer.
Die Probe ist mit Platin beschichtet, um die Oberflächendetails zu verbessern, und mit Kohlenstoff für die strukturelle Stabilität.
Übertragen Sie die Probe in ein Fläschchen mit einem Aufschlusspuffer, der Detergens enthält.
Inkubieren, um den Gewebeabbau zu erleichtern, wobei die Membran und die in die Beschichtung eingebetteten Proteine intakt bleiben.
Mit Puffer waschen, um Schmutz zu entfernen.
Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Führt primäre Antikörper ein, die spezifisch für das Ziel-neuronale Membranprotein sind.
Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Inkubieren Sie mit goldkonjugierten Sekundärantikörpern, die an Primärantikörper binden.
Mit Puffer waschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen.
Spülen Sie mit Wasser, um Artefakte durch Salzrückstände während der Mikroskopie zu vermeiden.
Montieren Sie die Probe auf ein Transmissionselektronenmikroskop oder TEM-Gitter.
Visualisieren Sie unter dem TEM das Ziel-neuronale Membranprotein, das durch Goldpartikel identifiziert wird, die als schwarze Punkte erscheinen.
Für den SDS-Aufschluss wird ein Nachbau in ein 4-Milliliter-Glasfläschchen gegeben, das mit 1 Milliliter SDS-Aufschlusspuffer gefüllt ist. Lassen Sie es 18 Stunden lang bei 80 Grad Celsius unter Schütteln verdauen. Für die Immunmarkierung waschen Sie das Replik 10 Minuten lang in frischem SDS-Verdauungspuffer. Dann wird es mit Primär- und Sekundärantikörpern, die in 2 % BSA TBS verdünnt sind, in einer feuchten Kammer bei 15 Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden inkubiert.
Montieren Sie danach das Replikat auf einem Formvar-beschichteten, 100-zeiligen Parallelstabgitter. Stellen Sie die Nachbildung mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 oder 100 Kilovolt dar. Nehmen Sie dann die digitalen Bilder über eine CCD-Kamera auf.