Native Chromatin-Immunpräzipitation von Neurosphärenzellen

Nehmen Sie Neurosphärenzellen in einem Puffer ein, der Detergenzien, Kalzium und Proteaseinhibitoren enthält.

Das Detergens permeabilisiert die Zellen, während der Inhibitor Proteasen inaktiviert, um das Chromatin-gebundene Zielprotein zu erhalten.

Nuklease zugeben und inkubieren. Die Nuklease verwendet Kalzium, um das Chromatin zu verdauen.

Fügen Sie einen EDTA-haltigen Puffer hinzu, der Kalzium chelatisiert und die Nuklease inaktiviert.

Fügen Sie Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren und das Chromatin freizusetzen.

Zentrifugieren und den Überstand auffangen.

Fügen Sie Antikörper hinzu, die für das Zielprotein spezifisch sind, und inkubieren Sie mit Rotation. Zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Führen Sie magnetische Beads ein, die auf den Antikörper abzielen, und inkubieren Sie mit Rotation.

Fügen Sie Lysepuffer hinzu, um unspezifisch gebundene DNA zu trennen.

Fangen Sie die Kügelchen magnetisch auf und entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen salzreichen Puffer hinzu, um unspezifisch gebundene Proteine zu trennen.

Fangen Sie die Kügelchen magnetisch auf und entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie einen Stabilisierungspuffer hinzu, fangen Sie die Kügelchen magnetisch ein und entfernen Sie die Verunreinigungen.

Resuspendieren Sie in einem Proteinase-K-Puffer, um die Proteine zu verdauen und die DNA freizusetzen.

Sobald die Neurosphären geerntet sind, zentrifugieren Sie 1 mal 10 auf die 6 Neurosphärenzellen pro Immunpräzipitation bei 300 mal g für 5 Minuten. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand dekantiert und das Neurosphärenpellet in einem Milliliter balancierter Salzlösung wieder suspendiert. Übertragen Sie die Suspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung und zentrifugieren Sie dann wie zuvor.

Als nächstes dekantieren Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in 95 Mikrolitern Verdauungspuffer, ergänzt 1 bis 100 mit Proteaseinhibitor-Cocktail pro 1 mal 10 zu den 6 Zellen. Pipettieren Sie die Zellen sofort auf und ab, um ein Verklumpen zu vermeiden und Blasenbildung zu vermeiden. Mischen Sie dann 5 Mikroliter 0,1x Mikrokokken-Nuklease und 145 Mikroliter Verdauungspuffer und geben Sie 5 Mikroliter verdünnte Mikrokokken-Nuklease pro 1 mal 10 zu den 6 Zellen. Schnippen Sie die Tube zum Mischen und legen Sie die Tube genau 12 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius heißen Block.

Der Mikrokokken-Nuklease-Verdau zur Fragmentierung des Chromatins ist der kritischste Schritt. Die richtige Chromatinfragmentierung ist wichtig, um eine hohe Auflösung für ChIP zu erreichen. Um sicherzustellen, dass dieser Schritt erfolgreich ist, inkubieren Sie mehrere Proben nacheinander, um sicherzustellen, dass es nicht zu einem Überverdau kommt.

Nach 12 Minuten fügen Sie den 6 Zellen 10 Mikroliter 10x Mikrokokken-Nuklease-Stopppuffer pro 1 mal 10 hinzu. Ab diesem Zeitpunkt müssen die Proben auf Eis aufbewahrt werden. Die Bioanalyseanalyse der verdauten Mikrokokken-Nuklease-Probe zeigt, dass der größte Teil der DNA in Mono-, Di- und Tri-Nukleosomen fragmentiert wurde. Als nächstes fügen Sie den 6 Zellen 110 Mikroliter 2x RIPA-Puffer hinzu, der 1 bis 100 mit Proteasehemmer-Cocktail pro 1 mal 10 ergänzt ist.

Schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen und zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei 4 Grad Celsius und 1.700 mal g. Übertragen Sie den Überstand, der das Chromatin enthält, auf ein normales 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis. Verwenden Sie RIPA-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren in einer Dosis von 1 bis 1.000 ergänzt wird, um das Chromatin so zu verdünnen, dass jedes IP ein Volumen von 100 bis 200 Mikrolitern hat. Entfernen Sie dann ein Aliquot, das 10 % des ChIP-Volumens als Eingabe-Sample entspricht.

Bereiten Sie die Eingabe vor, indem Sie 100 Mikroliter TE-Puffer hinzufügen, ergänzt mit Proteinase-K, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius. Messen Sie nach der Reinigung des Eingangs mit einem PCR-Aufreinigungskit die Konzentration des Eingangs mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Notieren Sie die Ergebnisse in einem Notizbuch. Fügen Sie 10 Mikroliter gewaschene Protein-A- und G-Magnetkügelchen pro IP hinzu, die an jeder Probe durchgeführt werden, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius mit einer Drehung bei 20 U/min.

Legen Sie die Probe auf einen magnetischen Halter und lassen Sie die Kügelchen sich trennen. Anschließend wird das benötigte Volumen in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Geben Sie den gewünschten Antikörper in jedes Röhrchen und wickeln Sie die Kappen dann mit Plastikparaffinfolie ein, um eine Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius mit Rotation wie zuvor. Am nächsten Tag die Röhrchen 10 Sekunden lang mit dem 2000-fachen g drehen. Geben Sie dann 10 Mikroliter Kügelchen zu jedem IP und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 4 Grad Celsius mit einer Rotation bei 20 U/min.

Dann legen Sie die Proben auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Geben Sie dann 150 Mikroliter RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren zu jedem IP und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 20 U/min. Legen Sie die Proben nach der Inkubationszeit auf einen Magnetständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Geben Sie dann 150 Mikroliter Lithiumchloridpuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitoren in niedriger Konzentration, zu jedem IP und inkubieren Sie bei 4 Grad Celsius mit einer Rotation bei 20 U/min für 5 Minuten.

Nach der Inkubationszeit legen Sie die Proben auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie die magnetischen Kügelchen sich trennen. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Geben Sie dann 150 Mikroliter kaltes TE ohne Proteasehemmer zu den Kügelchen und inkubieren Sie bei 4 Grad Celsius mit Rotation bei 20 U/min für 5 Minuten. Nach dem letzten Waschschritt wird die Probe in 100 Mikrolitern TE-Puffer, ergänzt mit der Endkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter Proteinase-K, erneut suspendiert und eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius inkubiert.