Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 4:06 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie einen chemisch fixierten Schnitt des Gehirns einer Maus.
Fügen Sie ein Hybridisierungsgemisch hinzu, das ein Permeabilisierungsmittel und RNA-Sonden enthält, die mit FITC oder DIG markiert sind.
Inkubieren, um die Zellpermeabilisierung und den Sondeneintritt zu ermöglichen.
Die Sonden binden an komplementäre Sequenzen auf MBP-mRNA, einem Referenzmarker, der ubiquitär in Oligodendrozyten exprimiert wird, oder ASPA-mRNA, dem Ziel.
Waschen, um ungebundene Sonden zu entfernen.
Fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Einführung von HRP-konjugierten Anti-FITC-Antikörpern, die auf die FITC-markierte Sonde abzielen.
Waschen, dann FITC-Tyramid hinzufügen.
HRP oxidiert FITC-Tyramid in eine hochreaktive Form, die an nahe gelegene Proteine bindet und das Fluoreszenzsignal verstärkt.
Waschen Sie den Blockierungspuffer und führen Sie ihn wieder ein.
Fügen Sie alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-DIG-Antikörper hinzu, die auf die DIG-markierte Sonde abzielen.
Waschen und tragen Sie die Fast Red-Lösung auf.
Die alkalische Phosphatase dephosphoryliert Fast Red und erzeugt einen fluoreszierenden Niederschlag.
Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Die Kolokalisation von Mpp- und ASPA-Signalen deutet auf die ASPA-Expression in Oligodendrozyten hin.
Die beiden Sonden in Hybridisierungspuffer verdünnen, auf 65 Grad Celsius vorgewärmt und gut mischen. Tragen Sie 300 Mikroliter Hybridisierungsmischung auf jeden Objektträger auf und bedecken Sie sie mit einem im Ofen gebackenen Deckglas. Anschließend werden die Objektträger über Nacht bei 65 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
Füllen Sie die Objektträger am nächsten Tag in ein Coplin-Glas mit vorgewärmtem Waschpuffer und waschen Sie die Objektträger 30 Minuten lang, zweimal bei 65 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger danach dreimal 10 Minuten lang mit MABT Waschlösung bei Raumtemperatur.
Zeichnen Sie in diesem Schritt mit einem hydrophoben Stift Kreise um die Gewebeschnitte. Anschließend werden die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit ISH-Blockierungspuffer in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-FITC-Antikörper.
Legen Sie dann die Objektträger in ein Coplin-Glas, das PBST enthält. Waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten in PBST und ersetzen Sie sie jedes Mal durch frisches PBST. Fügen Sie anschließend fluoreszierendes Tyramid zu den Objektträgern hinzu und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Geben Sie die Objektträger in ein Coplin-Glas und waschen Sie sie dreimal 10 Minuten lang in PBST.
Anschließend werden die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit ISH-Blockierungspuffer inkubiert. Inkubieren Sie die Objektträger dann über Nacht bei 4 Grad Celsius mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Anti-DIG-Antikörper. Danach waschen Sie sie dreimal für jeweils 10 Minuten mit MABT. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal mit 0,1 molaren Tris-HCL bei pH 8,2 für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Die schnelle rote Lösung filtrieren und die Objektträger bei 37 Grad Celsius mit schneller roter Lösung in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Da die Zeit für eine optimale Entwicklung variiert, sollten Sie die Objektträger regelmäßig mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen, um die Bildung von Niederschlag zu überwachen. Waschen Sie sie dann dreimal jeweils 10 Minuten lang mit PBST.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Detektion der mRNA-Expression in Oligodendrozyten mittels Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Das Verfahren umfasst die Hybridisierung von RNA-Sonden mit spezifischen mRNA-Zielsequenzen, gefolgt von einer Signalverstärkung und Visualisierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Die Oligodendrozyten spielen eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem.
- Das Verständnis der mRNA-Expression in diesen Zellen kann Einblicke in neurologische Erkrankungen liefern.
- Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie lassen sich spezifische mRNA-Ziele sichtbar machen.
- Hybridisierungstechniken sind entscheidend für die Untersuchung der Genexpression.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zum Nachweis von ASPA-mRNA in Oligodendrozyten.
- Verbesserung der Visualisierung von mRNA durch Signalverstärkung.
- Nachweis der Ko-Lokalisation von MBP- und ASPA-Signalen.
Verwendete Methoden
- Herstellung chemisch fixierter Maushirnschnitte.
- Auftragung der Hybridisierungslösung, die RNA-Sonden enthält.
- Verwendung von Blockierpuffern zur Verhinderung unspezifischer Bindung.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung der mRNA-Expression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bindung von Sonden an Ziel-mRNA-Sequenzen.
- Verstärkung der Fluoreszenzsignale durch enzymatische Reaktionen.
- Ko-Lokalisation der MBP- und ASPA-Signale bestätigte die ASPA-Expression.
- Die Methode zeigte sich als zuverlässig für die Untersuchung von mRNA in Oligodendrozyten.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist wirksam zur Detektion spezifischer mRNA in Gehirngeweben.
- Die Verstärkung des Fluoreszenzsignals verbessert die Visualisierungsmöglichkeiten.
- Diese Technik kann auf weitere Untersuchungen zur Oligodendrozytenfunktion angewandt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Doppelte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ermöglicht eine präzise räumliche Kartierung der Genexpression in Maushirnschnitten und unterstützt so die frühe Entdeckung und Zielvalidierung in der auf Neurobiologie ausgerichteten Forschung und Entwicklung. Die Methode ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis zweier RNA-Ziele mit hoher Empfindlichkeit, wodurch mechanistische Klarheit und eine verlässliche Vorhersagekraft für die Untersuchung von Signalwegen und die analyse expressionsspezifischer Zelltypen gewährleistet werden. Diese Fähigkeit ist entscheidend, um Zielstrukturen zu entlasten und die Entscheidungen im Portfolio im Bereich der ZNS-Wirkstoffforschung zu untermauern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung der Gen-Koexpression in definierten neuronalen Zellpopulationen.
- Unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem die Anwesenheit der Ziel-RNA in krankheitsrelevanten Zelltypen bestätigt wird.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung durch räumlich aufgelöste Expressionsanalyse.
- Bietet vorhersagende Sicherheit für die Weiterentwicklung von Zielstrukturen in Screening-Pipelines.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte, gewebebasierte Assays zur Weitergabe von Verbindungen für die Bewertung.
- Liefert quantitative und reproduzierbare Fluoreszenzsignale zur Assay-Standardisierung.
- Ermöglicht robuste Analyse der Kolokalisation zur Unterstützung multiplexer Screening-Strategien.
- Bereitet biologische Systeme für skalierbare, bildbasierte Workflows mit hohem Informationsgehalt vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Genexpressionsdaten mit krankheitsrelevanten neuronalen Schaltkreisen und Zelltypen.
- Unterstützt die Identifizierung translationsrelevanter Biomarker durch räumliche Transkriptomik.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem molekulare Befunde mit dem Gewebekontext verknüpft werden.
- Verringert das translationsbedingte Risiko, indem die Target-Bindung in relevanten Hirnregionen bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses doppelte FISH-Protokoll integriert sich in den Entdeckungs- bis präklinischen Kontinuum, indem es die hypothesengeleitete Validierung der Genexpression in situ ermöglicht und damit sowohl die Zielstrukturauswahl als auch Biomarker-Strategien unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Bestätigt die räumliche und zelltypspezifische Expression von Kandidatenzielen im Gehirngewebe.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Fluoreszenzdaten für die Assay-Entwicklung und -Optimierung.
- Analytik: Bietet Messungen zur Ko-Lokalisation und Intensität, um die Genexpression unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Entdeckungen mit der Validierung auf Gewebeebene zur Biomarker-Abstimmung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, anpassungsfähige Plattform für multiplexierte Genexpressionsanalysen über verschiedene ZNS-Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, reproduzierbare und skalierbare, gewebebasierte Assays.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitalallokation, indem die Biologie des Targets frühzeitig geklärt wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Ziele für das zentrale Nervensystem sowie von Biomarkern.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebemanipulation, der Sondenkonzeption und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt Zugang zu hochwertigen bildgebenden Verfahren und Infrastruktur für quantitative Analysen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Sondenmarkierung und Nachweisprotokolle über Teamgrenzen hinweg.
- Kann eine Anpassung an verschiedene Gewebetypen oder RNA-Ziele erfordern.
- Die Signalamplifikationsschritte müssen optimiert werden, um Empfindlichkeit und Spezifität auszugleichen.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026