Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen
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Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 4:06 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie einen chemisch fixierten Schnitt des Gehirns einer Maus.
Fügen Sie ein Hybridisierungsgemisch hinzu, das ein Permeabilisierungsmittel und RNA-Sonden enthält, die mit FITC oder DIG markiert sind.
Inkubieren, um die Zellpermeabilisierung und den Sondeneintritt zu ermöglichen.
Die Sonden binden an komplementäre Sequenzen auf MBP-mRNA, einem Referenzmarker, der ubiquitär in Oligodendrozyten exprimiert wird, oder ASPA-mRNA, dem Ziel.
Waschen, um ungebundene Sonden zu entfernen.
Fügen Sie einen Blockierungspuffer hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.
Einführung von HRP-konjugierten Anti-FITC-Antikörpern, die auf die FITC-markierte Sonde abzielen.
Waschen, dann FITC-Tyramid hinzufügen.
HRP oxidiert FITC-Tyramid in eine hochreaktive Form, die an nahe gelegene Proteine bindet und das Fluoreszenzsignal verstärkt.
Waschen Sie den Blockierungspuffer und führen Sie ihn wieder ein.
Fügen Sie alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-DIG-Antikörper hinzu, die auf die DIG-markierte Sonde abzielen.
Waschen und tragen Sie die Fast Red-Lösung auf.
Die alkalische Phosphatase dephosphoryliert Fast Red und erzeugt einen fluoreszierenden Niederschlag.
Visualisieren Sie unter einem Flu
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