Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Nimm feste und permeabilisierte Maushirnschnitte, die Neuronen enthalten, einschließlich cholinerger Neuronen, die Cholin-Acetyltransferase exprimieren.

Die Schnitte werden einer fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung unterzogen, um Ziel-mRNAs zu detektieren, die an cholinergen Axonen lokalisiert sind, was zu amplifizierten Signalen mit Fluoreszenzsonden führt, die mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden.

Füge eine Blockierungslösung hinzu, die Proteine und ein Quenchmittel enthält. Die Proteine verhindern eine unspezifische Bindung, und das Quenchmittel neutralisiert restliche Fixiermittel.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf die neuronale Cholin-Acetyltransferase abzielen.

Mit Puffer waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die an die Cholin-Acetyltransferase-gebundenen Primärantikörper binden.

Mit Puffer waschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen, dann in destilliertem Wasser spülen, um Pufferrückstände zu entfernen.

Montieren Sie die Scheiben mit Einbettmedien, die einen Kernfleck enthalten, um die Kerne zu markieren.

Mittels Fluoreszenzmikroskopie die Schichten abbilden, um die Ziel-mRNA-Signale und cholinergen Axone zu visualisieren, die mit spezifischen Antikörpern gefärbt wurden.

Bedecken Sie jede Scheibe mit 100 bis 200 Mikrolitern Blockierungslösung, die drei Milligramm pro Milliliter BSA, 100 Millimolar Glycin und 0,25 % Triton X-100 in PBS enthält. Decken Sie jeden Objektträger mit Parafilm ab und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation werden bei 100 bis 200 Mikrolitern Antikörper, die in einer Blockierungslösung auf die Objektträger verdünnt werden, hier ein Anti-Cholin-Acetyltransferase-Antikörper verwendet. Nach dem Abdecken mit Parafilm inkubieren die Objektträger zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass die Hirnschnitte nicht austrocknen. Falls erforderlich, tragen Sie 24 Stunden nach der Inkubation erneut Anti-chAT-Antikörperlösung auf die Hirnschnitte auf.

Nachdem Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 1X PBS gewaschen haben, geben Sie 100 bis 200 Mikroliter des entsprechenden Alexa-konjugierten Sekundärantikörpers zu den Objektträgern. Mit Parafilm abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.

Waschen Sie die Objektträger nach Ablauf der Stunde wie zuvor dreimal für jeweils fünf Minuten in 1X PBS und waschen Sie sie dann einmal mit destilliertem Wasser. Montieren Sie die Objektträger mit einem Einbettmedium, das DAPI enthält. Und dann visualisieren Sie die Gehirnschnitte unter dem Fluoreszenzmikroskop.