JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:01 Min. • April 28th, 2025
Nehmen Sie ein Modell für eine anästhesierte Kontrollratte und ein Modell für eine laserinduzierte Hirnverletzung.
Die Laseranwendung auf der rechten Hemisphäre schädigte Zellen und die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Blut vom Hirngewebe trennt.
Injiziere einen Tracking-Farbstoff in die kanülierte Schwanzvene, der durch den systemischen Kreislauf zum Gehirn wandert.
Der Farbstoff bindet an Plasmaproteine und gelangt durch die beschädigte BHS ins Hirngewebe.
Euthanasiere die Ratten.
Perfundiere die Ratten durch das Herz, um den Farbstoff aus dem Kreislauf zu entfernen.
Extrahieren und schneiden Sie das Gehirn, isolieren Sie die Scheiben von der verletzten Hemisphäre und homogenisieren Sie sie.
Behandeln Sie mit einer sauren Lösung, um Proteine zu denaturieren, wobei der proteingebundene Farbstoff freigesetzt wird.
Zentrifugieren und isolieren Sie den farbstoffhaltigen Überstand. Fügen Sie Alkohol hinzu, um die Fluoreszenz des Farbstoffs zu verbessern.
Übertragen Sie die Lösung auf eine Mikroplatte. Bei Anregung deutet eine höhere Fluoreszenzintensität im verletzten Gehirn auf eine laserinduzierte BHS-Schädigung hin.
Um die Häufigkeit von Brüchen der Blut-Hirn-Schranke zu beurteilen, laden Sie 24 Stunden nach der laserinduzierten Verletzung eine Spritze mit 2 % Evans-Blau-Farbstoff, verdünnt in 4 Millilitern pro Kilogramm Kochsalzlösung, und geben Sie die Lösung intravenös über die kanülierte Schwanzvene an die verletzten und Kontrollratten ab.
Lassen Sie die Lösung eine Stunde lang zirkulieren, bevor Sie mit chirurgischen Stiften und Scheren den Brustkorb des ersten Tieres öffnen. Perfundieren Sie das exponierte Herz mit abgekühlter 0,9%iger Kochsalzlösung über den linken Ventrikel bei einem Druck von 110 Millimetern, bis eine farblose Perfusionsflüssigkeit aus dem rechten Vorhof beobachtet wird.
Als nächstes entnehmen Sie das Gehirn und erhalten 2 Millimeter große rostrocaudale Scheiben. Trennen Sie die Schnitte der linken Gehirnhälfte von den Schnitten der rechten Gehirnhälfte, um eine getrennte Beurteilung der verletzten und nicht verletzten Hemisphären zu ermöglichen, und wiegen Sie die Proben. Homogenisieren Sie die Proben mit einem Mörser und einem Stößel und inkubieren Sie die Gewebeproben 24 Stunden lang in 50%iger Trichloressigsäure.
Am nächsten Tag zentrifugierten Sie die homogenisierten Hirngewebeproben 20 Minuten lang bei 10.000 g und Raumtemperatur. Mischen Sie 1 Milliliter des Überstands mit 1,5 Millilitern 96%igem Ethanol im Verhältnis 1 zu 3. Verwenden Sie dann einen Fluoreszenzdetektor bei einer Anregung von 620 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 680 Nanometern, um den Bruch der Blut-Hirn-Schranke zu beurteilen.