Transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung der synaptischen Vesikel-Endozytose in Hippocampus-Neuronen der Maus

Beginnen Sie mit der Behandlung von Hippocampus-Neuronen von Mäusen mit einem kaliumreichen Puffer, der Meerrettichperoxidase oder HRP enthält.

Hohes Kalium depolarisiert präsynaptische Neuronen und löst die synaptische Vesikel-Exozytose aus. Die Neuronen holen dann die synaptischen Vesikelmembranen durch Endozytose zurück, indem sie HRP in die neu gebildeten Vesikel einbauen. Fixieren Sie die Neuronen mit Glutaraldehyd und waschen Sie sie, um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen.

Füge Wasserstoffperoxid und ein chromogenes Substrat hinzu, das durch HRP oxidiert wird, um elektronendichte Ausfällungen zu bilden. Waschen, um nicht umgesetztes Substrat zu entfernen.

Mit Osmiumtetroxid behandeln, um den Membrankontrast zu verbessern, dann das überschüssige Reagenz abwaschen. Fügen Sie als Nächstes Uranylacetat hinzu, um den Organellenkontrast zu verbessern.

Dehydrieren Sie die Neuronen mit steigenden Ethanolkonzentrationen und betten Sie sie in Harz ein.

Mikroskopisch zelldichte Regionen identifizieren und herausschneiden. Bereiten Sie dann ultradünne Schnitte vor.

Übertragen Sie einen Abschnitt auf ein Kupfergitter und färben Sie ihn mit Kontrastmitteln gegen.

Mit Hilfe der Transmission