Transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung der synaptischen Vesikel-Endozytose in Hippocampus-Neuronen der Maus

Beginnen Sie mit der Behandlung von Hippocampus-Neuronen von Mäusen mit einem kaliumreichen Puffer, der Meerrettichperoxidase oder HRP enthält.

Hohes Kalium depolarisiert präsynaptische Neuronen und löst die synaptische Vesikel-Exozytose aus. Die Neuronen holen dann die synaptischen Vesikelmembranen durch Endozytose zurück, indem sie HRP in die neu gebildeten Vesikel einbauen. Fixieren Sie die Neuronen mit Glutaraldehyd und waschen Sie sie, um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen.

Füge Wasserstoffperoxid und ein chromogenes Substrat hinzu, das durch HRP oxidiert wird, um elektronendichte Ausfällungen zu bilden. Waschen, um nicht umgesetztes Substrat zu entfernen.

Mit Osmiumtetroxid behandeln, um den Membrankontrast zu verbessern, dann das überschüssige Reagenz abwaschen. Fügen Sie als Nächstes Uranylacetat hinzu, um den Organellenkontrast zu verbessern.

Dehydrieren Sie die Neuronen mit steigenden Ethanolkonzentrationen und betten Sie sie in Harz ein.

Mikroskopisch zelldichte Regionen identifizieren und herausschneiden. Bereiten Sie dann ultradünne Schnitte vor.

Übertragen Sie einen Abschnitt auf ein Kupfergitter und färben Sie ihn mit Kontrastmitteln gegen.

Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie erscheinen Vesikel, die HRP enthalten, als elektronendichte Strukturen.

Stimulieren Sie die Neuronenkultur des Hippocampus, indem Sie 1,5 Milliliter kaliumreiche Stimulationslösung in jede Vertiefung bei Raumtemperatur für 90 Sekunden geben. Bereiten Sie in diesem Schritt einen 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 vor. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Glutaraldehyd in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur.

Waschen Sie dann die Zellen dreimal sieben Minuten lang mit 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Bereiten Sie anschließend die DAB-Lösung vor und filtern Sie sie mit dem 0,22-Mikrometer-Filter. Tragen Sie anschließend 1,5 Milliliter DAB-Lösung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius auf die Zellen auf.

Waschen Sie dann die Zellen dreimal sieben Minuten lang mit 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Als Nachfixierung inkubieren Sie die Neuronen mit 1,5 Millilitern 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für eine Stunde bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie danach die Neuronen dreimal sieben Minuten lang dreimal mit 1,5 Millilitern 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer. Bereiten Sie anschließend 0,1 molaren Natriumacetatpuffer mit Natriumacetat und Eisessig vor. Waschen Sie die Zellen dreimal sieben Minuten lang mit 1,5 Millilitern 0,1 molaren Acetatpuffer.

Danach inkubieren Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern 1% Uranylacetat in 0,1 molaren Acetatpuffer für 1 Stunde bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit 1,5 Millilitern 0,1 molaren Acetatpuffer für jeweils sieben Minuten. In einem Abzug wird die neuronale Kultur mit einzelnen 1,5-Milliliter-Waschgängen mit 50 %, 70 % und 90 % Ethanol für jeweils sieben Minuten dehydriert, gefolgt von drei Waschgängen mit 1,5 Millilitern 100 % Ethanol für jeweils sieben Minuten.

Als nächstes stellen Sie das Epoxidharz her und mischen es gründlich und lagern es unter Vakuum, um Luftblasen zu entfernen. Infiltrieren Sie die Probe, indem Sie das Ethanol durch 50 % Epoxidharz in Ethanol auf einem Schüttler für 30 Minuten bei Raumtemperatur ersetzen, dann 70 % Epoxidharz und Ethanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.

Wechseln Sie die Epoxidharzlösung mit 100% Epoxidharz und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei 50 Grad Celsius. Führen Sie zwei Austausche von frischem 100% Epoxidharz durch. Jeder Austausch wird eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius inkubiert. Fügen Sie dann frisches 100% Epoxidharz hinzu und lassen Sie es über Nacht bei 50 Grad Celsius und dann über 36 Stunden bei 60 Grad Celsius aushärten.

Entnehmen Sie anschließend jede Probe mit der Handsäge des Juweliers aus der Multi-Well-Platte. Wählen Sie mit einem inversen Lichtmikroskop die interessierenden Regionen mit hohen Zellkonzentrationen aus. Schneiden Sie dann die Blöcke von 4 x 5 x 8 Millimetern würfeln, um sie zu schneiden. Anschließend wird die Schnitte durch Eintauchen mit 1 % wässrigem Uranylacetat für 15 Minuten und dann mit 3 % wässrigem Bleicitrat für 5 Minuten gegengefärbt, um den Kontrast der Proben zu verbessern.