Abbildung der intrazellulären ATP-Dynamik mit FRET-basierten Sensoren in einem organotypischen Hippocampus-Schnitt der Maus
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:40 Min. • April 28th, 2025
Sichern Sie eine organotypische Maus-Hippocampus-Scheibe in einer experimentellen Kammer.
Die Scheibe enthält transduzierte Neuronen und Astrozyten, die einen ATP-Sensor mit fluoreszierenden Donor- und Akzeptorproteinen exprimieren.
Setze die Kammer auf einen Fluoreszenzmikroskoptisch und durchdringe sie mit sauerstoffreichem ACSF.
Erlauben Sie dem Slice, sich an die gepufferten Bedingungen anzupassen.
Fokussieren Sie mit Transmissionslicht das Slice und identifizieren Sie den Interessenbereich.
Wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus und regen Sie das fluoreszierende Donorprotein an, um die Fluoreszenzemission zu initiieren.
Nach der ATP-Bindung erfährt der Sensor Konformationsänderungen, die einen fluoreszenzbasierten Energietransfer vom Donor zum Akzeptor ermöglichen, der Fluoreszenz bei einer längeren Wellenlänge emittiert.
Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel und Bandpassfilter, um Donor- und Akzeptoremissionen zu isolieren und zu trennen.
Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz für die Hintergrundsubtraktion. Identifizieren Sie dann die Zielzellen und zeichnen Sie ihre Fluoreszenz im Zeitverlauf auf.
Berechnen Sie das FRET-Verhältnis, um den intrazellulären ATP-Spiegel in Echtzei
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos