Einbettung des Drosophila-Gehirns in eine Matrix für die Zeitraffer-Bildgebung der Neuronen der zirkadianen Uhr
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:08 Min. • May 29th, 2025
Beginnen Sie mit einem Petrischalendeckel, der das Larvengehirn von Drosophila enthält, das einem Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt ist. Die Scheibe enthält fluoreszierende Protein-exprimierende Uhrenneuronen.
Fügen Sie ein nährstoffreiches Medium mit Antibiotika zur Unterstützung des neuronalen Überlebens und eine warme Fibrinogenlösung hinzu.
Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um das Fibrinogen gleichmäßig zu verteilen.
Geben Sie eine kleine Menge dieser Mischung auf das Deckglas einer Glasbodenschale.
Fügen Sie Thrombin hinzu, um mit Fibrinogen zu reagieren und die Bildung einer dreidimensionalen Fibrinmatrix zu induzieren.
Übertragen Sie das Gehirn auf diese Matrix und positionieren Sie es mit der vorderen Seite nach unten, um die Uhrenneuronen für die Bildgebung auszurichten.
Falten Sie die Matrix über das Gehirn, um sie zu verankern und Bewegungen zu verhindern.
Fügen Sie nährstoffreiches Medium hinzu, um die Thrombinaktivität zu inaktivieren.
Verschließen Sie die Schale mit einer gasdurchlässigen Membran, um die Hydratation und die Lebensfähigkeit der Neuronen zu erhalten.
Führen Sie in bestimmten Abständen eine Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung durch.
Die Fluoreszenzveränderungen in den Uhrenneuronen zeigen ihre rhythmische Aktivierung und Hemmung, synchronisiert mit dem Hell-Dunkel-Zyklus, und spiegeln den zirkadianen Rhythmus, den täglichen Aktivitätszyklus, wider.
Nachdem Sie das Gehirn in die Arbeitslösung überführt haben, geben Sie das Gehirn und das Medium auf den Deckel einer sterilen Petrischale. Fügen Sie dann weitere 3,5 Mikroliter SAM mit Antibiotika hinzu und fügen Sie 3,5 Mikroliter warmes SAM mit Fibrinogen hinzu.
Es ist wichtig, das SAM-Medium während dieses Verfahrens mit Fibrinogen auf 37 Grad zu halten.
Mischen Sie anschließend die Lösung um das Gehirn herum, indem Sie vorsichtig mit derselben Pipettenspitze pipettieren und aspirieren Sie 2 Mikroliter der Lösung, um sie auf einem Deckglas für eine Glasbodenschale abzugeben. Fügen Sie dann 0,8 Mikroliter Thrombin zum Tröpfchen hinzu und mischen Sie sehr schnell, um die Polymerisation zu initialisieren, die weiß erscheint. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gehirn vorsichtig zu berühren und es auf die polymerisierende Fibrinmatrix zu setzen.
Hinzufügen des Thrombins, nachdem das Gehirn auf das Tröpfchen übertragen wurde. Es wird nicht empfohlen, da es das Verfahren sehr kompliziert.
Richten Sie das Gehirn nach Bedarf aus und schieben Sie das Gehirn ganz sanft so nah wie möglich an das Deckglas. Nehmen Sie dann eine Schicht polymerisiertes Fibrin und falten Sie sie mit kleinen und sanften Bewegungen, die die Matrix nicht ablösen, auf das Gehirn. Falten Sie weiterhin Schichten von polymerisiertem Fibrin aus verschiedenen Teilen des Gerinnsels über das Gehirn, um das Gehirn zu stabilisieren. Lagern Sie dann 20 Mikroliter SAM mit Antibiotika über dem eingebetteten Gehirn ab, um die Thrombinaktivität zu stoppen. Legen Sie dann ein Stück PTFE-Membran über das Medium und kleben Sie die Ränder der Membran auf die gefetteten Teile der Schale.
Übersicht
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Abbildung der Uhr-Neuronen im Gehirn von Drosophila-Larven unter Verwendung einer dreidimensionalen Fibrin-Matrix. Das Verfahren ermöglicht die Beobachtung rhythmischer neuronaler Aktivität als Reaktion auf Licht/Dunkel-Zyklen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- Drosophila melanogaster ist ein Modellorganismus zur Untersuchung zirkadianer Rhythmen.
- Uhr-Neuronen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der täglichen Aktivitätszyklen.
- Fluoreszierende Proteine ermöglichen die Visualisierung neuronaler Aktivität.
- Fibrin-Matrizen bieten eine unterstützende Umgebung für das Überleben von Neuronen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Einbettung und Abbildung von Neuronen im Drosophila-Gehirn.
- Beobachtung der rhythmischen Aktivierung von Uhrenneuronen.
- Untersuchung der Synchronisation der neuronalen Aktivität mit Hell-Dunkel-Zyklen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Fibrinmatrix unter Verwendung von Thrombin und Fibrinogen.
- Einbettung des larvalen Drosophila-Gehirns in die Fibrinmatrix.
- Zeitraffer-Fluoreszenzbildgebung zur Überwachung neuronaler Aktivität.
- Verwendung einer gasdurchlässigen Membran zur Aufrechterhaltung der Hydratation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einbettung von Uhrenneuronen in eine Fibrinmatrix.
- Beobachtung rhythmischer Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf Hell-Dunkel-Wechsel.
- Nachweis der Lebensfähigkeit der Neuronen während der Bildgebung.
- Erkenntnisse über die circadianen Rhythmen von Drosophila-Uhrenneuronen.
Schlussfolgerungen
- Die Fibrin-Matrix-Methode eignet sich zur Abbildung neuronaler Aktivität.
- Dieser Ansatz kann das Verständnis zirkadianer Rhythmen bei Drosophila verbessern.
- Zukünftige Studien könnten die Bedeutung dieser Befunde in weiter gefassten Zusammenhängen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der zirkadianregulierten neuronalen Aktivität in einem genetisch zugänglichen Modell und unterstützt die Target-Validierung in der Neuropharmakologie. Durch die Stabilisierung des Gehirngewebes in einer permissiven 3D-Matrix erlaubt sie die Langzeit-Bildgebung der Dynamik von Uhrenneuronen unter kontrollierten Umweltreizen. Der Ansatz bietet eine reproduzierbare Plattform zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf zirkadiane Signalwege in einem frühen Stadium der Wirkstoffentdeckung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der Modulation zirkadianer Signalwege in intakten neuronalen Schaltkreisen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit der neuronalen Rhythmisierung in Echtzeit verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem die neuronale Vitalität und die Funktion des fluoreszierenden Reporters erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung, um die Reproduzierbarkeit fluoreszenzbasierter Messwerte über verschiedene Experimente hinweg zu verbessern.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bindet krankheitsrelevante Systeme ein, indem es zirkadiane Funktionsstörungen modelliert, einen mechanistischen Faktor bei Schlaf- und Stoffwechselstörungen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente, bildgebungstaugliche Gewebeprotektion.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen die mechanistische Risikominimierung zirkadianer Zielstrukturen vor der Identifizierung von Leitsubstanzen priorisiert wird.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem direkte Beobachtungen der Reaktionen von Taktneuronen auf Hell-Dunkel-Reize ermöglicht werden.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Einbettung, die Gewebeverschiebungen minimiert und die Signalintegrität während der Zeitrafferaufnahmen erhält.
- Analytik: Erzeugt quantitative Fluoreszenzmessungen über die Zeit, die statistische Vergleiche der neuronalen Aktivierungszustände unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem ein evolutionär konservierter biologischer Prozess modelliert wird, der für menschliche zirkadiane Störungen relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die zirkadiane Neurobiologie, die zwischen Entwicklungs- und präklinischen Teams geteilt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielmodulation, indem die Uneindeutigkeit in der Dynamik neuronaler Antworten verringert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit von Protokollen zur neuronalen Bildgebung über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige funktionelle Daten zur Aktivierung des circadianen Signalwegs bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Wirkung auf die Rhythmen der zentralen Uhrenneurone.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Drosophila-Neuroanatomie und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Hängt von der Verfügbarkeit temperaturgesteuerter Ausrüstung für die Fibrinpolymerisation bei 37 °C ab.
- Erfordert die Standardisierung der Thrombin-/Fibrinogen-Verhältnisse, um konsistente Matrixeigenschaften sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Modellsysteme oder neuronale Subtypen angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Opazität der Matrix, die die Bildauflösung in tieferen Gewebeschichten beeinträchtigen kann.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026