JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:41 Min. • May 29th, 2025
Nehmen wir eine kurzfristige neuronale Kultur des Hippocampus einer Ratte, die junge Neuronen repräsentiert, und eine Langzeitkultur, die gealterte Neuronen repräsentiert.
Gealterte Neuronen weisen eine höhere Dichte an spannungsgesteuerten Kalziumkanälen vom L-Typ (L-VGCCs) auf, die nach der Membrandepolarisation länger offen bleiben.
Inkubieren Sie mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator, der in die Zellen diffundiert, und waschen Sie ihn dann, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
Legen Sie die Kulturen in eine Perfusionskammer unter ein Fluoreszenzmikroskop.
Führen Sie eine Lösung ein, die Neurotransmitter enthält, die an Rezeptoren auf den Neuronen binden, den Einstrom von Natriumionen induzieren und die Membrandepolarisation auslösen.
Die Depolarisation aktiviert die L-VGCCs, wodurch der Kalziumeinstrom in das Zytoplasma ermöglicht wird.
In der Langzeitkultur führt die höhere Dichte und die verlängerte Öffnung von L-VGCCs zu einer Kalziumüberladung, einem Kennzeichen der neuronalen Alterung
.Die Bindung von Kalzium an den Indikator erzeugt Fluoreszenz, wobei gealterte Neuronen eine höhere Fluoreszenzintensität aufweisen, was einen erhöhten intrazellulären Kalziumspiegel nach der Stimulation widerspiegelt.
Bei diesem Verfahren inkubieren Sie die Zellen mit Fura2-AM für 60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und überführen dann die Deckgläser in die Perfusionskammer. Legen Sie danach die Perfusionskammer mit dem Deckglas in die Halterung auf das inverse Mikroskop. Wählen Sie das mikroskopische Feld und perfundieren Sie die Zellen kontinuierlich mit vorgewärmtem HBS.
Anschließend wird die Zellen bei 340 und 380 Nanometern epi-beleuchtet und anschließend das bei 520 Nanometern emittierte Licht alle 5 bis 10 Sekunden mit einer Fluoreszenzkamera aufgezeichnet, die von einem dichroitischen Fura-2-Spiegel gefiltert wird. Zur Analyse der aufgenommenen Fluoreszenzbilder. Öffnen Sie zunächst die Experimentdatei.
Klicken Sie in der AquaCosmos-Software auf Verhältnis und wählen Sie den gewünschten Verhältnisbereich aus. Berechnen Sie das Pixel-für-Pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Abfolge von Verhältnisbildern zu erhalten. Subtrahieren Sie dann den Hintergrund, indem Sie die Schaltfläche für die Hintergrundbeleuchtung anpassen. Drücken Sie danach auf Berechnung starten. Drücken Sie anschließend die Schaltfläche All Time Sequence und löschen Sie die alten ROIs.
Für die quantitative Analyse einzelner Zellen legen Sie neue ROIs oder die ROIs fest, die den einzelnen Neuronen entsprechen. Um die einzelnen Aufzeichnungen grafisch darzustellen, exportieren Sie die Fluoreszenzwerte des Verhältnisses, die jedem ROI entsprechen, in das Ursprungslaborprogramm, indem Sie auf Diagramm klicken. Klicken Sie dann auf Berechnen und speichern Sie die TXT-Datei. Führen Sie danach die entsprechende Berechnung durch, um die Größe des Anstiegs des Fluoreszenzverhältnisses als Reaktion auf jede Stimulation abzuschätzen.