Verwendung der spektralen Reflektometrie zur Bestimmung myelinisierter Axondurchmesser in einem fixierten Maushirnschnitt

Nehmen Sie ein hyperspektrales konfokales Mikroskop mit einer stabilisierten Laserquelle, die für einen breiten Spektralbereich konfiguriert ist, um die Nanostruktur der Myelinscheide des Gehirngewebes zu entschlüsseln.

Verwenden Sie einen Referenzspiegel, um das Reflexionsspektrum der Grundlinie zu erfassen. Entfernen Sie den Spiegel und erhalten Sie ein dunkles Offset-Spektrum für die Korrektur des Detektorrauschens.

Übertragen Sie eine Kammer mit einem fixierten Hirngewebeschnitt auf den Mikroskoptisch.

Richten Sie die Fokusebene auf den interessierenden Gewebebereich aus und stellen Sie eine ausreichende Tiefe sicher, um Interferenzen durch die Glas-Gewebe-Grenzfläche zu minimieren.

Das Laserlicht wird auf die mehrschichtige Myelinscheide der Axone gerichtet.

Bei der Wechselwirkung des Lichts mit dem Myelin kommt es an den Grenzflächen der Schichten zu partiellen Reflexionen, die aufgrund unterschiedlicher Schichtdicken und Brechungsindizes Interferenzmuster erzeugen.

Erfassen Sie Spektralbilder dieser Interferenzmuster.

Nach der Baseline-Korrektur und Signalanalyse zeigt das Reflexionsspektrum die Wellenzahlperiodizität an, was die Bestimmung der myelinisierten Axondurchmesser ermöglicht.

Montieren Sie einen Referenzspiegel auf dem Mikroskoptisch, wobei die Oberfläche zur Objektivlinse zeigt. Wenn es nicht einfach ist, den Spiegel auf den Mikroskoptisch zu stellen, kleben Sie einen Spiegel auf die flache Platte. Stellen Sie den Mikroskoptisch so ein, dass die Brennebene an der Spiegeloberfläche ausgerichtet ist. Passen Sie dann die PMT-Verstärkung und die Laserleistung unter Berücksichtigung des Dynamikbereichs des Detektors an.

Überprüfen Sie unter einer Pseudofarbe, ob im gesamten Wellenlängenbereich keine Sättigung vorhanden ist. Wenn eine Sättigung beobachtet wird, verringern Sie die Laserleistung. Führen Sie dann die Lambda-Scan-Erfassung aus. Nehmen Sie den Spiegel vom Tisch und wiederholen Sie die gleiche Aufnahme ohne Probe, um die dunkle Referenz zu erhalten. Speichern Sie dann die Daten in einem mehrfach gestapelten TIFF-Format.

Um die SpeRe-Bildaufnahme durchzuführen, legen Sie das montierte Gewebe auf den Mikroskoptisch. Um das Gewebe durch ein Okular grob auf die Brennebene der Objektivlinse auszurichten, verwenden Sie den Weitfeld-Fluoreszenzmodus. Steuern Sie bei eingeschaltetem Live-Scan den Mikroskoptisch, um die Brennebene auf den interessierenden Bereich im Gewebe auszurichten. Um Hintergrundgeräusche durch das Deckglas zu vermeiden, wählen Sie einen Zielbereich von mindestens 15 Mikrometern Tiefe aus der Glasgewebegrenzfläche.

Erfassen Sie den spektralen Bildstapel für den Zielbereich mit dem gleichen Verfahren, das zuvor in diesem Video gezeigt wurde. Speichern Sie dann die Daten für das Gewebe und den dunklen Versatz im mehrfach gestapelten TIFF-Format. Um die Bilder in ImageJ zu verarbeiten, öffnen Sie die Spektraldaten für den Referenzspiegel und das Hirngewebe

Wählen Sie die ROIs für die geöffneten Bildstapel, den zentralen Bereich für den Referenzspiegel und das Segment einer Axonfaser für das Hirngewebe aus. Führen Sie dann das Z-Achsen-Profil aus, stapeln und plotten, um die Rohspektren für die ausgewählten ROIs zu erfassen.

Die Axonfasern können entlang ihrer Länge strukturell heterogen sein, daher wird empfohlen, den ROI auf einem kleinen Axonsegment, typischerweise weniger als 5 Mikrometer, zu wählen, um Teilvolumenartefakte zu minimieren.

Öffnen Sie die Dunkelversatzdaten, von denen eine für den Referenzspiegel und die andere für das Hirngewebe aufgenommen wurde, und stellen Sie das Profil der Z-Achse wie gerade gezeigt dar. Verwenden Sie dann die Optionen Kopieren und Einfügen, um alle erworbenen Optionen zu speichern.