Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in retinalen Zapfen-Photorezeptoren von Mäusen

Legen Sie ein Deckglas mit membranmontiertem Netzhautgewebe der Maus unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop.

Das Gewebe exprimiert einen FRET-basierten Calcium-Biosensor in Zapfen-Photorezeptoren.

Konzentrieren Sie sich mit einem Wasserimmersionsobjektiv auf das Gewebe.

Bei Hintergrundbeleuchtung bleiben die Axonendigungen des Kegels depolarisiert, was einen Kalziumeinstrom ermöglicht.

Die intrazelluläre Kalziumbindung verändert die Konformation des Biosensors und bringt die Donor- und Akzeptorfluorophore einander näher.

Beginnen Sie mit der Zwei-Photonen-Bildgebung.

Der Laser des Mikroskops fokussiert niederenergetisches Nahinfrarotlicht in das Gewebe.

Im Brennpunkt des Lasers regen zwei Photonen gleichzeitig den Biosensor an und lösen so den Energietransfer vom Donor zum Akzeptor aus.

Dadurch wird die Akzeptorfluoreszenz erhöht, während die Donorfluoreszenz verringert wird.

Berechnen Sie das Fluoreszenzverhältnis.

Führen Sie als Nächstes eine Lichtstimulation durch, um die Zapfen zu hyperpolarisieren und den intrazellulären Kalziumspiegel zu reduzieren.

Dadurch wird die Konformation des Biosensors rückgängig gemacht, der Energietransfer vom Donor zum Akzeptor wird gehemmt und das Fluoreszenzverhältnis gesenkt.

Zeichnen Sie die Reaktionen auf, um die lichtevozierte Kalziumdynamik in Kegelaxonendigungen zu analysieren.

Übertragen Sie eine Scheibe aus der Haltekammer in die Aufnahmekammer und beginnen Sie sofort mit der Perfusion mit einer kohlenstoffsauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung. Halten Sie eine Perfusionsflussrate von 2 Millilitern pro Minute und eine Temperatur von 37 Grad Celsius in der Aufnahmekammer aufrecht. Verwenden Sie ein 20-faches Wasserimmersionsobjektiv mit 0,95 NA und eine CCD-Kamera in Kombination mit einer Infrarot-LED unter der Aufnahmekammer, um die Netzhautscheibe zu lokalisieren.

Starten Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungssystem, wie vom Hersteller angegeben. Schalten Sie als Nächstes den Laser ein und stellen Sie ihn auf 860 Nanometer ein. Schalten Sie die beiden Detektionskanäle für die Fluoreszenzbildgebung von ECFP und Citrin ein. Steuern Sie anschließend mit der Bilderfassungssoftware das Zwei-Photonen-Mikroskop, um eine Reihe von Kegelanschlüssen für die Aufzeichnung zu scannen und auszuwählen. Stellen Sie die Bildaufnahme auf Bilder mit 128 x 16 Pixeln oder eine ähnliche Konfiguration ein.

Beschränken Sie den gescannten Bereich auf die Kegelenden, um ein Ausbleichen von Photopigmenten in den äußeren Segmenten zu vermeiden. Schalten Sie den Laser ein. Lassen Sie die Zapfen 20 bis 30 Sekunden lang an den Scanning-Laser und das Stimulus-Hintergrundlicht anpassen, bevor Sie Lichtreize präsentieren oder pharmakologische Wirkstoffe auftragen. Beginnen Sie nun mit der Darstellung der willkürlichen Reize. Die Reize werden erzeugt, indem die Intensität der beiden LEDs über die Zeit moduliert wird, wobei eine Mikroprozessorplatine verwendet wird, die von einer kundenspezifischen Software gesteuert wird. Starten Sie dann die gleichzeitige Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle mit der jeweiligen Bildaufnahmesoftware.