Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Beginnen Sie mit einem in Agarose eingebetteten dorsalen Netzhautexplantat eines transgenen Zebrafisches, das in einer Fluoroschale mit Medien montiert ist.

Die Netzhaut weist lichtinduzierte Photorezeptorschäden auf und enthält Müller-Gliazellen oder MGCs mit Zellkernen, die GFP exprimieren.

Stellen Sie die Schale in eine Kammer mit Multiphotonenmikroskop

Fokussieren Sie mit Hellfeldbeleuchtung auf die Netzhaut.

Wechseln Sie in den Fluoreszenzmodus, um die MGCs zu lokalisieren.

Konfigurieren Sie einen Z-Stack von der Ganglienzellschicht (GCL) zur äußeren Kernschicht (ONL).

Starten Sie die Live-Bildgebung.

Beschädigte Photorezeptoren setzen TNF-α frei und aktivieren die MGCs.

MGC-Kerne wandern basal innerhalb der inneren Kernschicht (INL), um ihre DNA zu replizieren.

Dann wandern die Zellkerne apikal zum ONAL, um eine Mitose zu durchlaufen und neuronale Vorläuferzellen zu produzieren.

Nach der Mitose wandern die MGC-Kerne und Vorläuferzellen basal zurück zum INL.

Die Vorläuferzellen vermehren sich, wandern zur Verletzungsstelle und differenzieren sich zu Photorezeptoren, was die Regeneration der Netzhaut ermöglicht.

Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder, um die nukleare Migration zu visualisieren.

Öffnen Sie in der Bildaufnahmesoftware die Fenster A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI und ND Acquisition. Stellen Sie für die Multiphotonen-Bildgebung sicher, dass die Option IR NDD im A1 Compact GUI-Fenster ausgewählt ist. Wählen Sie dann im Einstellfeld IR-DM für den ersten dichroitischen Spiegel aus und überprüfen Sie, ob der Bandpassfilter auf 525 bis 50 eingestellt ist, um GFP-Fluoreszenz zu erfassen.

Schalten Sie anschließend den IR-Laser im A1 MP GUI-Fenster ein. Es dauert einige Minuten, bis der Laser bereit ist. Stellen Sie danach die Wellenlänge auf 910 Nanometer ein, um die GFP-Fluoreszenz anzuregen, und richten Sie den Laser aus, indem Sie auf die Schaltfläche Automatische Ausrichtung klicken.

Nachdem Sie die Netzhautkultur auf den Multiphotonen-Mikroskoptisch gelegt haben, stellen Sie sicher, dass die Raum- und Gerätebeleuchtung ausgeschaltet ist, bevor Sie den Verschluss öffnen, um eine Überbelichtung der Photomultiplier-Röhre zu vermeiden. Um den Geräuschpegel zu reduzieren, stellen Sie das Mikroskop in einer abgedunkelten Umgebung auf.

Erfassen Sie Bilder mit einem Sichtfeld von 300 x 300 Pixeln bei einem Zoom von 2, die im Fenster "Scanbereich" eingestellt sind, und einer Pixelverweilzeit von 4,8 Mikrosekunden pro Pixel, die im A1 Compact GUI-Fenster ausgewählt wurde. Stellen Sie die Laserleistung grob ein, indem Sie den Erfassungsbereich im A1 MP GUI-Fenster und die Verstärkung im A1 Compact GUI-Fenster ändern.

Konzentrieren Sie sich nun auf die Ganglienzellschicht und legen Sie die obere Fokusebene des Z-Stapels im Z-Unterfenster innerhalb des ND-Erfassungsfensters fest. Bewegen Sie die Fokusebene durch die Ebene der äußeren Kernschicht, die durch das Vorhandensein von schwach markierten GFAP- und GFP-positiven Zellen gekennzeichnet ist, die im Vergleich zu ihren Gegenstücken in der inneren Kernschicht rund und vergrößert sind.

Legen Sie diese Ebene als unteren Rand des Z-Stapels fest. Stellen Sie als Nächstes die Z-Schrittgröße zwischen 0,7 und 1 Mikrometer ein. Um die Z-Intensitätskorrektur einzurichten, öffnen Sie das Fenster "Z-Intensitätskorrektur" und wählen Sie "Aus ND", um den Z-Stapelbereich festzulegen. Klicken Sie dann auf die untere Fokusebene im Fenster "Z-Intensitätskorrektur" und stellen Sie die Laserintensität und -verstärkung ein.

Klicken Sie anschließend auf den Pfeil neben den Z-Werten im Fenster Z-Intensitätskorrektur, um die Einstellungen zu bestätigen, die anschließend unter Geräteeinstellungen im Fenster Z-Intensitätskorrektur für die ausgewählte Fokusebene angezeigt werden. Wiederholen Sie den Vorgang für die mittlere und obere Ebene, um die Laserleistung und -verstärkung zu erhöhen.

Stellen Sie den Aufnahmebereich im A1 MP GUI-Fenster ein und vermeiden Sie es, zu Beginn der Bildgebung einen Aufnahmebereich größer als 15 und eine Verstärkung über 126 auszuwählen, um Photobleaching und erhöhten Rauschpegel zu umgehen. Wählen Sie anschließend die Option "Relative Intensitätskorrektur" im Fenster "Z-Intensitätskorrektur". Legen Sie im Unterfenster Zeitreihe des Fensters ND-Erfassung die Dauer auf acht Stunden und das Intervall auf keine Verzögerung fest. Klicken Sie dann im Unterfenster "Z-Stapel" des Fensters "ND-Erfassung" auf die Option "Z-Korrektur ausführen", um 3D-Zeitreihen zu erfassen.