Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie zur Visualisierung von Metallen im Hirngewebe von Mäusen

Legen Sie eine Gewebeprobe und Standards aus dem Gehirn einer Maus in eine Laserablationskammer.

Die Standards enthalten bekannte Konzentrationen von Metallen, die in Homogenate aus dem Hirngewebe von Lämmern inspiziert sind.

Füllen Sie die Kammer mit Argongas und fokussieren Sie einen ultravioletten Laserstrahl auf das Gewebe.

Der Laser verdampft die Probe und die Standards in einem linearen Muster, wodurch ein Aerosol aus feinen Partikeln entsteht.

Argongas transportiert die Teilchen in das induktiv gekoppelte Plasma, eine Hochtemperatur-Ionisationsquelle.

Das Plasma zerstäubt und ionisiert die Teilchen zu positiv geladenen Ionen.

Die Ionen gelangen in das Massenspektrometer und werden anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses getrennt.

Die resultierenden Daten werden mit einer Referenzdatenbank verglichen, um die in der Probe vorhandenen Metalle zu identifizieren. Aus den Standards wird eine Kalibrierkurve generiert.

Berechnen Sie die Metallkonzentrationen in der Probe, indem Sie ihre Signalintensitäten mit denen der Standards kalibrieren, um die räumliche Verteilung der Metalle innerhalb des Gehirnschnitts zu ermitteln.

Legen Sie zunächst eine Gehirngewebeprobe und alle mit der Matrix übereinstimmenden Gewebestandards in die Laserablationskammer. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben innerhalb der Schärfentiefe der LACCD-Kamera befinden. Schließen Sie die Kammertür und ziehen Sie die Schrauben mit den Fingern fest.

Öffnen Sie dann in der ICP-MS-Software das Trägergasventil und stellen Sie die Durchflussmenge auf 1,2 Liter pro Minute ein. Führen Sie in der LA-Software eine 30-minütige Spülung der Ablationszelle mit dem Trägergas für eine 2-Volumen-Ablationszelle durch. Bewegen Sie den Probentisch alle 10 Minuten in jede Ecke der Kammer, um die Restluftmenge in der Zelle zu reduzieren.

Schalten Sie das ICP-MS ein und lassen Sie das Instrument zwei Stunden lang aufwärmen. Während sich das Instrument aufwärmt, ziehen Sie in der Laserablationssoftware eine etwa 3 Millimeter lange Ablationslinie über die Oberfläche des ersten Gewebestandards. Klicken Sie auf die Ablationslinie und legen Sie den Standardstrahldurchmesser, die Scangeschwindigkeit und die Strahlungsfluenz fest. Duplizieren Sie die Linie sechsmal, und halten Sie den Abstand zwischen den Linien um den Balkendurchmesser fest. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Norm.

Verwenden Sie dann das Linienwerkzeug, um den Ablationsbereich über dem Muster von der oberen linken Ecke über den breitesten Punkt des Musters zu zeichnen, wobei Sie dieselben Parameter wie für die Standards verwenden.

Duplizieren Sie die Linie nach Bedarf, um eine vollständige Abdeckung der Probe mit dem gleichen Abstand wie in den Standards zu erzielen. Zeichnen Sie dann spätestens nach 20 Stunden nach dem Scannen der Probe oder zwischen den einzelnen Proben einen Satz Linien für das intermittierende Scannen der Standards. Fügen Sie am Ende des Experiments einen Scan der Standards hinzu.

Bestimmen Sie anhand der Zeilenlänge und der Scangeschwindigkeit die Analysezeit für die Proben- und Normleitungen. Erstellen Sie dann einen neuen Stapel in der ICP-MS-Software und wählen Sie Zeitaufgelöste Analyse. Wählen Sie die interessierenden Werte für das Verhältnis von Masse zu Ladung aus, und legen Sie die Integrationszeiten für jedes Verhältnis fest, sodass die Gesamtintegrationszeit für einen Zyklus 0,25 Sekunden beträgt. Speichern Sie den Stapel.

Füllen Sie für eine Standardcharge die Analysezeit für jede Linie mit einem zusätzlichen Puffer von 15 Sekunden aus, um die Aufwärm- und Auswaschzeiten des Lasers zu berücksichtigen. Legen Sie eine Beispiellaufliste mit einer Erfassung für jede Normzeile fest. Duplizieren Sie für die Beispielcharge die Standardcharge, und passen Sie die Zeiten und die Anzahl der Aufnahmen entsprechend für das Probenablationsmuster an.

Sobald sich das ICP-MS aufgewärmt hat, fügen Sie die erste Charge zur Warteschlange hinzu und stellen Sie sicher, dass die Software auf einen Trigger vom LA-Instrument wartet. Schalten Sie dann in der LA-Software die Laserstromversorgung ein und stellen Sie die Aufwärm- und Auswaschzeiten des Lasers ein. Starten Sie die Lasersequenz und überprüfen Sie, ob das ICP-MS die Datenerfassung nach der Ablation korrekt startet.

Nachdem die Daten gesammelt wurden, extrahieren Sie die Daten für die Standards aus den CSV-Dateien. Führen Sie eine Basisliniensubtraktion durch und schließen Sie das Hintergrundsignal aus. Identifizieren Sie Signalverluste, die durch Löcher in den Gewebestandards verursacht werden.

Maskieren Sie diese Bereiche mit niedrigem Signal und exportieren Sie die Daten dann als Tabelle. Berechnen Sie für jedes identifizierte Element einen Umrechnungsfaktor von CPS in PPM. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Norm.

Öffnen Sie als Nächstes die Software zur quantitativen Bildkonstruktion und importieren Sie die Beispieldaten aus den CSV-Dateien. Wählen Sie mehrere Bereiche des Hintergrunds aus, um die Hintergrundkorrektur anzuwenden. Wählen Sie das Diagrammbearbeitungswerkzeug aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Bilddarstellung ändern. Ändern Sie die erste Farbe bei Z in einen großen negativen Wert.

Und klicken Sie auf Fertig, um das Hintergrundsignal zu verbessern. Geben Sie dann auf der Registerkarte Standards die CPS PPM-Korrekturfaktoren für jeden Standard ein und klicken Sie auf Go. Öffnen Sie den Datenbrowser auf der Registerkarte Daten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine korrigierte Bilddatei und klicken Sie auf Neues Bild.

Öffnen Sie das Fenster "Bilddarstellung ändern" und legen Sie die Farbtabelle und den Maßstab fest. Verwenden Sie das Dienstprogramm Anmerkung hinzufügen, um eine Farbskala auf dem Bild zu platzieren. Passen Sie die Farbskala im Farbskalenfenster an. Nachdem das Bild koloriert und kommentiert wurde, kopieren Sie das Bild entweder und fügen Sie es in ein anderes Programm ein oder exportieren Sie das Bild aus der Bildkonstruktionssoftware.

Um die ROI-Tools zu aktivieren, wählen Sie Bildverarbeitung aus den Analysepaketen und wählen Sie ein Bild aus. Klicken Sie auf der Registerkarte Bild auf ROI und starten Sie ROI Draw. Wählen Sie die gewünschte Region aus und klicken Sie dann auf ROI beenden.

Klicken Sie auf der Registerkarte Bild auf Statistiken, um die ROI-Daten abzurufen. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass sie gespeichert werden, wenn jeder ROI hinzugefügt wird. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf.