Konzentration der Metabolite von Low-Density-Planktonic Gemeinschaften für Umweltforschung Metabolomics mit Kernresonanzspektroskopie

Die NMR-Spektroskopie bietet mehrere eindeutige Vorteile für die Umwelt-Metabolomik-Forschung, weist jedoch bei diesem Verfahren eine relativ geringe Empfindlichkeit auf. Es wird eine Filtrationsmethode zur Anreicherung und Extraktion von Metaboliten ganzer Gemeinschaften aus planktischen Systemen, die für die NMR geeignet sind, beschrieben. Dies wird erreicht, indem zunächst speziell Filter für die Probenentnahme vorbereitet werden, indem Extrahierbare entfernt werden.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Probe, entweder natürlich oder experimentell, auf die Filter zu filtrieren. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Konservierung des Probenmaterials und die Extraktion der Metaboliten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Analyse der Proben mittels NMR-Spektroskopie und die entsprechende Integration der Daten.

Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die metabolische Veränderungen in natürlichen Proben entlang von Umweltgradienten oder als Reaktion auf experimentelle Manipulationen mittels Metabolomik- und Transam-Ansätzen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Zentrifugation besteht darin, dass die gesamte Gemeinschaft erfasst werden kann und größere Probenmengen für Proben mit geringer Dichte möglich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Umwelt-Metallmix-Bereich zu beantworten, beispielsweise wie mikrobielles Wachstum auf Umweltveränderungen reagiert. Die Demonstration des Verfahrens wird von Stage und From aus meinem Labor durchgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Filter mit einer Pinzette in einen sauberen 500-Milliliter-Pyrex-Becher geben. Bedecken Sie den Filter mit destilliertem Wasser, um ihn vorzuspülen, und schwenken Sie gut, um zu verhindern, dass die Filter aneinanderhaften. Gießen Sie das Wasser ab und wiederholen Sie den Spülvorgang zweimal.

Nach dem letzten Spülgang 300 Milliliter Milli-Q-Wasser zum Becher hinzufügen und die Filter autoklavieren. Sobald die Filter autoklaviert wurden, das Milli-Q-Wasser abgießen und die Filter dreimal wie zuvor spülen, wobei jedoch Milli-Q-Wasser verwendet wird.

Legen Sie die einzelnen Filter auf eine saubere, trockene Oberfläche, beispielsweise Aluminiumfolie, mit einer Pinzette ab und trocknen Sie sie bei einer angemessenen Temperatur. Zum Beispiel bei 37 Grad oder lufttrocknen; die Filter sind nun bereit, für die Demonstration dieses Protokolls verwendet zu werden. Ein Millipore-Edelstahl-Dreifach-Filtrationsmanifold, ausgestattet mit 25 Millimeter Mikroanalyse-Filterkolonnen mit Glasunterlagen und einer mechanischen Pumpe, wird unter Verwendung aseptischer Technik eingesetzt.

Platzieren Sie einen einzelnen 25-Millimeter-Filter auf der Basis der Filtersäule. Setzen Sie die Säule auf und klemmen Sie die Apparatur zusammen. Geben Sie hier 15 Milliliter der Probe aus einem nährstoffreichen Mikrokosmos auf die Säule.

Öffnen Sie das Absperrventil am Filtermanifold und schalten Sie die Pumpenfiltration bei sanftem Druck ein, um eine Zellzerstörung zu minimieren. Bei Proben mit geringerer Dichte können mehrfache Zugaben von Wasser erforderlich sein. Achten Sie darauf, dass der Filter zwischen den Wassergaben nicht über einen längeren Zeitraum austrocknet.

Zweitens, verbleibende paramagnetische Salze aus marinen Proben reduzieren; optional kann eine Süßwasser-Spülung durchgeführt werden. Sobald die Filtration abgeschlossen ist, schalten Sie die Pumpe aus und lassen das Ventil geöffnet, sodass weiterhin Unterdruck unter dem Filter besteht. Entfernen Sie die Klemme und die Filterkolonne mit einer Hand.

Verwenden Sie saubere Pinzette, um den Filter zu greifen. Falten Sie den Filter, ohne ihn mit der anderen Hand zu knicken, und verwenden Sie die Öffnung eines sterilen Mikrozentrifugenröhrchens mit zwei Milliliter Volumen, um den Filter festzuhalten.

Legen Sie den Filter in die 2-ml-Röhrchen und geben Sie ihn so frei, dass er sich mit der Probenoberfläche nach innen öffnet. Gefrieren Sie sofort in flüssigem Stickstoff, um die wasserlöslichen Metaboliten zu extrahieren. Rekonstituieren Sie die Proben zunächst über Nacht oder mindestens 10 Stunden nach der Lyophilisierung, und geben Sie danach je eine Stahlkugel zu jedem Röhrchen hinzu.

Fügen Sie 750 Mikroliter standardisierten Kaliumphosphatpuffer und Deuteriumoxid mit DSS-Standard hinzu. Sonizieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei vier Grad in einer Wassersondierung, um das Zellmaterial vom Filter zu entfernen. Entfernen Sie die Filter mit sauberen Pinzetten.

Zerstören Sie die Zellen mithilfe eines Mühlenzerkleinerers bei 1600 U/min für fünf Minuten. Anschließend bei 65 Grad Celsius inkubieren. Dabei 15 Minuten auf einem Laborrührer schütteln.

Nach der Inkubation den Metallmörser mit sauberen Pinzetten entfernen. Die Probe bei 13.000 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Überstände abziehen und direkt in eine NMR-Röhre zur NMR-Spektroskopie überführen.

Geben Sie die Probe in das NMR-Spektrometer ein. Die Proben werden an einem Bruker DRX 500-Spektrometer mit TXI-Probe und Triple-Achsen-Gradient bei 298 Kelvin durchgeführt. Sperren, abstimmen und shimmen Sie den Magneten.

Erhalten Sie 1D-Protonen-NMR-Spektren unter Verwendung der Top-Spin-Oberfläche und zuvor beschriebener Methoden oder nutzen Sie bei Bedarf andere Spektrometer-Software-Schnittstellen. Hier wurden Spektren durch Unterdrückung der Restwasser-Signale mittels der Watergate-Impulssequenz mit einer Wiederholzeit von 1,2 Sekunden aufgezeichnet. Im vorliegenden Beispiel wurden 128 Transienten für jede Probe gesammelt.

Übertragen Sie die NMR-Datendverzeichnisse auf einen Personalcomputer mit installierter NMR-Pipe-Software. Verarbeiten Sie die Rohdaten, setzen Sie das DSS-Signal als Null-PPM-Referenz und phasen Sie die Spektren manuell nach. Digitalisieren Sie die Spektraldaten durch Binning unter Verwendung des öffentlich verfügbaren FT-two-B-Pakets von der E-Commerce-Website.

Andere Software-Tools wie RNMR oder Atomics können ebenfalls zur Bin-Datenerstellung verwendet werden. Die Daten können auf das Gesamtsignal oder das DSS-Signal normalisiert werden, um proportionale Signaländerungen zwischen den Proben darzustellen. Die Ausgabedaten können nun für nachfolgende statistische Analysen verwendet werden, beispielsweise für eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mithilfe kostenloser Softwarepakete wie R, wie gezeigt.

Hier ist ein Beispiel für Protonen-NMR-Spektren, die mit dem demonstrierten Verfahren erhalten wurden. Die Spektren stammen aus zwei Zeitpunkten eines Mikrokosmus-Experiments und zeigen deutliche Unterschiede aufgrund algenbedingter Stoffwechselaktivitäten. Das Spektrum vom Tag vier weist eine beträchtliche Anzahl von Signalen auf, insbesondere im Bereich von 3 bis 4:00 Uhr im Vergleich zur Probe vom Tag eins.

Diese Peaks können Zuckern zugeschrieben werden, die durch blühende Diatomeen im Mikrokosmos produziert wurden. In einem ähnlichen Experiment wurde ein PCA-Score-Plot, abgeleitet von der Krümmung in Mr.Spectra und die ersten beiden Hauptkomponenten darstellend, verwendet, um das Wachstum natürlicher Planktongemeinschaften in künstlichem und natürlichem Meerwasser zu vergleichen. Dieser statistische Ansatz reduziert mehrdimensionale Daten hier in ein einfacheres, zweidimensionales Format und zeigt einfach die Struktur der zugrundeliegenden Datenpunkte nahe beieinander an.

Hier sind eine oder beide Achsen stärker ähnlich. Klar erkennbare metabolische Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen sind vorhanden. Die Daten dieses Experiments wurden zur Durchführung einer Multi-Omics-Analyse verwendet.

Kombiniert man NMR mit genomischen Daten, zeigt die Analyse der Gemeinschaftszusammensetzung basierend auf der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese von 18S- und 16S-rRNA-Genen ebenfalls deutliche Unterschiede in den mikrobiellen Gemeinschaftsmustern zwischen natürlichen und künstlichen Meereswasser-Mikrokosmen. Eine solche Übereinstimmung zwischen Metabolom und Genom aus natürlichen Systemen verdeutlicht die Nützlichkeit dieses Ansatzes. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine geeignete Technik anzuwenden, um Kontaminationen während des gesamten Verfahrens zu minimieren.

Weitere Methoden wie die Erstellung von Analysen auf Omics-Ebene können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie das Mikrobiom mit bestimmten Metaboliten korreliert.