Subpiale Genverabreichung im Rückenmark der Maus zur Bewertung der Genexpression

Nehmen Sie eine betäubte Maus, rasieren Sie ihren Rücken und desinfizieren Sie die Haut.

Schnitte die Haut, löse die Muskeln von den Wirbeln und ziehe sie mit Klammern zurück.

Bohren Sie in die Wirbellaminae, um Risse zu erzeugen, und entfernen Sie dann die Knochenfragmente, um die Dura mater, die äußere Rückenmarksmembran, freizulegen.

Schaffen Sie mit einer Nadel eine durale Öffnung und punktieren Sie die darunter liegende Pia mater, um in den subpialen Raum einzudringen und direkten Zugang zum Wirbelsäulengewebe

zu erhalten.

Nehmen Sie eine Verabreichungsnadel, die eine Suspension eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus enthält, die ein fluoreszierendes Protein-exprimierendes Gen trägt, und injizieren Sie die Suspension.

Ziehen Sie die Nadel zurück, nähen Sie die Muskeln und die Haut und lassen Sie die Maus sich erholen.

Das Virus bindet an Rezeptoren auf Neuronen und Gliazellen und wird endozytiert.

Sobald sich das Virus im Zellkern befindet, löst es die Genexpression aus, um fluoreszierende Proteine zu produzieren.

Das subpiale Gentransfermodell ist nun bereit, die Expression von Zielgenen im Rückenmark zu bewerten.

Beginnen Sie damit, das Tier für die Operation richtig zu betäuben. Hier kommt Isofluran zum Einsatz. Stellen Sie sicher, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Pfote gibt, bevor Sie fortfahren. Bedecken Sie dann die Augen mit Augensalbe. Rasieren Sie anschließend den Rücken des Tieres mit einer Schermaschine und reinigen Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin.

Wenn lumbale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, wird die Haut über den Wirbeln T8 bis L1 mit einem Skalpell geschnitten. Und dann lösen Sie mit einer Schere den Paravertebralmuskel von den Wirbeln T10 bis T12. Montieren Sie das Tier mit Maus-Wirbelsäulenklemmen in einen standardmäßigen stereotaktischen Rahmen. Als nächstes rasieren Sie mit einem Zahnbohrer beide Seiten der Lamina der Wirbel T10 bis T12, bis Risse entstehen.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um rissige Knochenfragmente zu entfernen und die dorsale Oberfläche des lumbalen Rückenmarks freizulegen. Die Dura ist nun sichtbar. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel aus Edelstahl, um einen 1 bis 2 Millimeter großen Schnitt in die Dura zu machen.

Es ist wichtig, die Dura vorsichtig aufzuschneiden, um Verletzungen der darunter liegenden Pia-Membran zu vermeiden.

Fassen Sie nun mit einer Pinzette den Rand der geschnittenen Dura und verlängern Sie die Dura-Öffnung um bis zu 5 Millimeter. Montieren Sie die 34-Gauge-Pia-Einstechnadel und die 36-Gauge-Injektionsnadel mit Glaskapillarhaltern an den Z-Armen von zwei separaten XYZ-Manipulatoren.

Verwenden Sie anschließend eine 50-Mikroliter-Mikrospritze, die mit einem PE-10- oder PE-20-Schlauch verbunden ist, um das AAV9-UBI-GFP-Virus zu laden. Nachdem das Virus geladen wurde, verbinden Sie das Ende des Schlauchs mit der Injektionsnadel. Während Sie dann durch ein chirurgisches Präparierfernrohr schauen, das auf 8- bis 10-fache Vergrößerung eingestellt ist, senken Sie mit dem X-Arm die Pia-Einstechnadel bis zu einer Tiefe von 1 Millimeter in die Pia ab. Halten Sie den Winkel der eindringenden Nadel bei 5 bis 10 Grad relativ zur Gewebeoberfläche.

Nachdem Sie die Pia geöffnet haben, verwenden Sie den X-Arm, um die Pia-Eindringnadel aus dem Subpialraum zu entfernen. Notieren Sie sich die penetrierte Stelle anhand eines Orientierungspunkts, z. B. eines Blutgefäßes. Bewegen Sie die X-, Y- und Z-Arme des zweiten Manipulators, um die Spitze der mit AAV9-Viren beladenen Injektionsnadel an der Pia-penetrierten Stelle zu positionieren.

Nachdem Sie die Spitze der Injektionsnadel etwa 0,5 Millimeter in den subpialen Raum eingeführt haben, heben Sie die Pia mit dem Z-Arm etwa 0,3 Millimeter an, und schieben Sie die Nadel dann mit dem X-Arm horizontal weiter in den subpialen Raum. Schieben Sie die Nadel vor, bis sie in einer Tiefe von etwa 2 bis 3 Millimetern in den Subpialraum eintritt.

Verwenden Sie dann die 50-Mikroliter-Mikrospritze, um das AAV9-UBI-GFP-Virus in den subpialen Raum zu injizieren. Entfernen Sie die Injektionsnadel aus dem subpialen Raum, nachdem die AAV9-UBI-GFP-Injektion abgeschlossen ist. Verschließen Sie den Muskel und die Haut mit Fluormonofil-Nahtmaterial und chirurgischen Clips. Lassen Sie das Tier sich auf einem Heizkissen erholen, bevor es in einem sauberen Käfig untergebracht wird.