Name: Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenzmarkierung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor zur mikroskopischen Analyse. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung früher Virus-Wirt-Zell-Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde von der National Medical Research Council, Singapore finanziert.

1. Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus <ol><li> Vor der Kennzeichnung Reaktion zu reinigen Dengue-Virus mit Saccharose-Kissen und bereiten die notwendigen Reagenzien und Geräte wie im Protokoll angegeben. </li><li> Bereiten Sie frische 0,2 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 8,5 (Kennzeichnung Puffer) und 1,5 M Hydroxylamin, pH 8,3 (Stop-Reagenz), kurz bevor die Kennzeichnung und Filter mit 0,2 um Spritzenfilter sterilisieren. </li><li> Verdünnen Sie ca. 3x10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) von gereinigtem Dengue-Virus in 1 ml Kennzeichnung Puffer in einem 2 ml Tube. Dies kann anteilig für Batch-Kennzeichnung von Virus skaliert. </li><li> Das lyophilisierte Alexa Fluor 594 (AF594) Succinimidylestern bis 1mm in der Kennzeichnung Puffer unmittelbar vor der Etikettierung Reaktion. Andere Fluorochrome aus der Alexa Fluor Farbstoff-Serie können je nach eigenen Bedürfnissen eingesetzt werden. Minimierung der Exposition gegenüber von diesem Schritt ab Licht. </li><li> Add 100 &amp;mgr; der 1mM AF594 Farbstoff der verdünnten Virus unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze. </li><li> Inkubieren Sie die Kennzeichnung Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten. </li><li> Drehen Sie das Rohr kurz in einer Tischzentrifuge und fügen 100 &amp;mgr; von Stop-Reagenz, um die Reaktion Mischung unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten. </li></ol> 2. Purifying Alexa Fluor markierte Dengue-Virus <ol><li> In der Zwischenzeit Gleichgewicht der Reinigung Säule mit Puffer der Wahl. In diesem Versuch wird ein PD-10 Säule mit 25 ml HNE-Puffer (5 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, vor Gebrauch. </li><li> Übernehmen der markierten Virus an die Spitze der Säule und sammeln Sie die Flow-Through einmal die markierten Virus in der Matrix. Füllen Sie die Spalte mit HNE-Puffer, wenn alle markierten Virus der Matrix eingetragen hat. Verwerfen Sie den ersten 2,5 ml Flow-Through und sammeln Sie die nächsten 2 ml des markierten Virusfraktion. </li><li> Aliquotieren und lagern gereinigt AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus in -80 ° C, weit weg von der Lichtquelle. </li></ol><ol><li> Tauwetter ein Aliquot und bestimmen den Titer der markierten Virus durch Plaque-Assay bevor Sie das Batch-markierter Virus. </li><li> Seed 5x10 4 pro Vertiefung von Vero-Zellen, in M-199 Wachstumsmedium, in einem 4-Well-Platte mit einem Deckglas auf dem Boden des gut einen Tag vor der Infektion. </li><li> Entfernen Sie den Kulturüberstand in gut und infizieren die Zellen mit Multiplizität der Infektion von 1 des markierten Virus in 100 &amp;mgr; l Volumen (verdünnt in M-199 Wartungs-Medium bei Bedarf) für 10min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Impfkulturen und waschen Sie die Deckgläser zweimal in 1xPBS. </li><li> Fix die Zellen in 3% paraformalydehyde für 30 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in 1xPBS. </li><li> Permeabilisieren die Zellen mit Permeabilisierung Lösung mit 0,1% Saponin und 5% BSA in 1xPBS für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit unverdünntem Zentrifugation-geklärte Überstand von 3H5 monoklonaler Antikörper Hybridom-Kultur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer (1xPBS mit 1mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1% Saponin). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit AF488 Anti-Maus-IgG-Antikörper, 1:100 in Permeabilisierung Lösung verdünnt, für 45 Minuten in feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer und spülen Sie einmal in deionisiertem Wasser. </li><li> Dab den Rand des Deckglases gegen ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser abtropfen lassen und Montage auf Glasträger mit 8μl Mowiol 4-88 mit 2,5% Dabco. </li><li> Lassen Sie die Montage-Lösung über Nacht eingestellt bei 4 ° C vor der Anzeige mit einem Zeiss-konfokalen Mikroskop. Sequential Akquisitionen sollte spannend Fluorophor in einer Zeit, und das Umschalten zwischen den Detektoren gleichzeitig durchgeführt werden. </li><li> Die Bilder werden dann für die Co-Lokalisierung des E-Proteins Antikörper-Färbung mit den markierten Virus mit dem Zeiss LSM Zen-Software auf den Grad der Kennzeichnung Schätzung analysiert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für die Ausbeute an Dengue-Virus mit AF594 Farbstoff markiert ist in Abbildung 2 dargestellt. Normalerweise sollte weniger als 10-fach Drop von der ersten Titer nach erfolgreicher Kennzeichnung eingehalten werden. Allerdings ist anzumerken, dass alle Puffer bereit für die Kennzeichnung, erfolgreich zu sein und die Alexa Fluor Succinimidylestern sollte sofort nach der Rekonstitution verwendet werden, da sie hydrolysieren in reaktiven freien Säuren in wässrigen Lösungen 8 frische werden müssen. Als nächstes muss der markierten Virus, um eine ausreichende Fluoreszenz vor der Verwendung in Experimenten überprüft werden. Eine einfache Immunfluoreszenztest auf Vero-Zellen durchgeführt und der Grad der Etikettierung können von der Co-Lokalisation des markierten Virus mit Anti-E-Protein Antikörper-Färbung abgeschätzt werden. Trennenal-Zellen wurden untersucht und eine typische konfokale Abbildung ist in Abbildung 3 dargestellt. Co-Lokalisation Analyse der Bilder mit der LSM Software Zen gezeigt überlappen Koeffizienten zwischen 0,65 bis 0,8, was darauf hindeutet, dass etwa 65 bis 80% der Virionen mit dem Farbstoff markiert wurden. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1.Die Schema der Darstellung der Alexa Fluor Farbstoff Kennzeichnung von Dengue-Virus Verfahren. Erstens, die relevant Puffer und gereinigt Dengue-Virus vorbereitet sind. Die Alexa Fluor Farbstoff rekonstituiert und hinzugefügt, um die Dengue-Virus in der Kennzeichnung verdünnt. Die Reaktion wird dann 1 Stunde später mit der Zugabe von Stop-Reagenz beendet. Anschließend wird der markierte Virus durch eine Größenausschluss-Säule gereinigt, um freie Farbstoff zu entfernen. Schließlich ist die Bezeichnung Virus durch Plaque-Assay erneut titriert und getestet für die Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Mittlere Anzahl der lebensfähigen Virionen (pfu / ml) als auf einem Plaque-Assay vor und nach AF594 Kennzeichnung bestimmt. Ein Aliquot des AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus wird aufgetaut und wieder titriert mittels Plaque-Assay und es zeigt typischerweise weniger als 10-fach Drop aus der Ausgangspunkt Titer. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von Duplikaten. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Co-Lokalisation von AF594 Etiketten mit Dengue-Virus E-Proteine ​​in Vero-Zellen. Zellen auf Deckgläsern gewachsen Vortag wurden mit AF594 gekennzeichnet Dengue bei MOI von 1 für 10 Minuten bei 37 ° C infiziert Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit anti-E-Antikörper, untersucht und für Kolokalisation von E-Protein (grün) und AF594 Kennzeichnung (rot). Fluoreszenzsignale wurden visualisiert unter 63X Vergrößerung mit Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop. Scale-Bar ist 10 um. Gelb zeigen Bereiche von Kolokalisation, wie im Kasten dargestellt.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
<li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Alexa+Fluor+Succinimidyl+Esters+%28Molecular+Probes%22">Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes</a>. , Invitrogen. (2009).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

Obwohl AF594 Farbstoff in diesem Bericht verwendet wurde, ist eine breite Palette von Fluorophoren in der Alexa Fluor Succinimidylestern Serie mit ähnlichen Kennzeichnung Chemie. Dies könnte zu verlängern die Kennzeichnung Anwendung über Bildgebung. Die Durchflusszytometrie kann als Alternative zur konfokalen Mikroskopie für die Einschätzung des Grades der Kennzeichnung für Fluorophore, die angeregt und detektiert werden durch die FACS-Maschine verwendet werden kann. Alexa Fluor-Farbstoffe s...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Merck </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 Succinimidylestern </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 Säule </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Sail Marke </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 Hybridom </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1st Base </td><td> BUF-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> Zur Vorbereitung M-199 Wachstumsmedium, fügen Sie 50 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter. Zur Vorbereitung M-199 Wartungs-Medium, fügen Sie 15 ml FBS, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren zu 500ml M-199, sterile Filter.

visualizing dengue virus durch alexa fluor labeling

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Die frühen Ereignisse bei der Interaktion zwischen Virus und Zelle kann großen Einfluss auf das Ergebnis der Infektion haben. Ermittlung der Faktoren, die diese Interaktion beeinflussen könnten zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankung führen und damit Einfluss Impfstoff oder therapeutische Design. Daher wäre die Entwicklung von Methoden, um diese Wechselwirkung Sonde nützlich sein. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung Fluorophore 1-3 und Imaging-Technologie 4 kann ausgenutzt werden, um unserem derzeitigen Kenntnisstand auf Dengue Pathogenese zu verbessern und somit den Weg zu den Millionen von Dengue-Infektionen, die jährlich zu reduzieren. Der umhüllte Dengue-Virus verfügt über eine externe Gerüst, bestehend aus 90 Hüllglycoprotein (E)-Dimere Schutz der Nukleokapsid Schale, die eine einzelne positive Strang-RNA-Genom 5 enthält. Die identische Protein-Untereinheiten auf der Virusoberfläche können somit mit einem Amin reaktiven Farbstoff markiert und visualisiert werden durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Hier präsentieren wir eine einfache Methode zur Kennzeichnung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoff direkt in einem Natriumbicarbonatpuffer, die sehr tragfähig Virus nach der Kennzeichnung ergab aufgelöst. Es gibt kein standardisiertes Verfahren für die Kennzeichnung von lebenden Virus und bestehenden Protokoll des Herstellers für Protein-Kennzeichnung erfordert in der Regel die Wiederherstellung der Farbstoff in Dimethylsulfoxid. Die Anwesenheit von Dimethylsulfoxid, selbst in kleinsten Mengen, blockieren kann produktive Infektion von Viren und induzieren auch Zell-Zytotoxizität 6. Der Ausschluss von der Verwendung von Dimethylsulfoxid in diesem Protokoll somit reduziert diese Möglichkeit. Alexa Fluor Farbstoffe überlegen Photostabilität und sind weniger pH-empfindlicher als die gemeinsame Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin 2, wodurch sie ideal für Studien zur zellulären Aufnahme und endosomalen Transport des Virus. Die Konjugation von Alexa Fluor Farbstoff keinen Einfluss auf die Anerkennung der Bezeichnung Dengue-Virus durch Virus-spezifische Antikörper und ihre vermeintliche Rezeptoren in Host-Zellen 7. Diese Methode könnte nützliche Anwendungen in der virologischen Untersuchungen.

Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

Die frühen Ereignisse bei der Interaktion zwischen Virus und Zelle können einen tiefgreifenden Einfluss auf den Ausgang der Infektion haben. Die Bestimmung der Faktoren, die ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, das Dengue-Virus für mikroskopische Untersuchungen fluoreszenzmarkiert darzustellen. Bereiten Sie die notwendigen Puffer vor und reinigen Sie das Dengue-Virus mithilfe eines Saccharosepolsters. Rekonstituieren Sie den Amy React Alexa Fluor Farbstoff und das Dengue-Virus im Markierungspuffer. Markieren Sie das Dengue-Virus mit hundert Mikromolar Alexa Fluor.Incubieren Sie eine Stunde lang und stoppen Sie die Markierungsreaktion mit dem Sub-Reagenz. Reinigen Sie das markierte Denguevirus über eine Größenausschluss-Säule. Bestimmen Sie die neue Virus-Titer mittels Plaque-Assay und schätzen Sie den Markierungsgrad mittels Immunfluoreszenz-Assay.Hallo, ich bin Sam Jang vom DSO National Laboratories und arbeite im Labor von Dr. Wee im Programm für neu auftretende Infektionskrankheiten nach dem Abschluss der medizinischen Fakultät der NUS. Heute zeige ich Ihnen, wie man Denki-Virus mit einem Amyl-reactiven Alexa-Fluor-Farbstoff fluoreszenzmarkiert, um bildgebende Untersuchungen durchzuführen. Alexa-Fluor-Farbstoffe weisen eine höhere Stabilität auf und sind weniger pH-empfindlich als herkömmliche Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin, wodurch sie sich ideal für Studien zum zellulären Uptake und zum endosomalen Transport des Virus eignen.Mit einem Alexa-Fluor-markierten Dengue-Virus wird das Verständnis der Dengue-Pathogenese erleichtert. Beginnen wir also. Vor der Markierungsreaktion bereiten Sie frisch den Markierungspuffer und das Stoppreagenz gemäß dem schriftlichen Protokoll vor und reinigen Sie das Dengue-Virus mittels Saccharose-Cushion. Geben Sie eine geeignete Menge des gereinigten Dengue-Virus in Markierungspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Konzentration von 300 Millionen infektiösen Einheiten pro Milliliter zu erreichen.Dies kann proportional vergrößert werden, um eine Chargenmarkierung des Virus durchzuführen. Lösen Sie den lyophilisierten Alexa-Fluordye unmittelbar vor der Markierungsreaktion in Markierungspuffer auf eine Konzentration von einem Millimolar auf.Ab diesem Schritt die Belichtung durch Licht minimieren. Zu Demonstrationszwecken wird der Alexa-Fluoreszenzfarbstoff unbeleuchtetsschutz belassen. 800 Mikroliter der einmillimolaren Alexa-Fluoreszenzfarbstofflösung zu dem verdünnten Denguevirus geben, während leicht mit der Mikropipettenspitze gerührt wird.Einmal stundenlang bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen mischen, dabei vor Licht geschützt halten. Nach einer Stunde die Röhrchen kurz zentrifugieren. 800 Mikroliter der Unterfraktion entnehmen, dabei vorsichtig mit der Mikropipette mischen, und weitere eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, dabei vor Licht geschützt halten und alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen mischen.Unterdessen equilibrieren Sie die Reinigungssäule mit 25 Milliliter HNE-Puffer. Nach der einstündigen Inkubation wird das markierte Virus auf die Säule aufgetragen und der Durchlauf gesammelt. Füllen Sie die Säule mit HNE-Puffer auf. Sobald das gesamte markierte Virus in die Matrix eingetreten ist, entsorgen Sie die ersten 2,5 Milliliter des Durchflusses und sammeln die nächsten zwei Milliliter der markierten Virusfraktion. Ecor und lagern Sie das gereinigte, markierte Virus bei Minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie den Titer des markierten Virus mittels Plaque-Assay.In einem typischen Experiment sollte ein geringerer als zehnfacher Abfall der Virus-Titers beobachtet werden. Nach der Markierung sollte ein Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um den Grad der Markierung zu bewerten. Dazu zählen Sie die viralen Zellen mithilfe eines Hämozytometers und geben ein geeignetes Volumen an Zellen in das Wachstumsmedium, um eine Dichte von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.Geben Sie je ein Milliliter viraler Zellen pro Vertiefung in eine Vier-Vertiefungs-Platte, die eine sterile Glasabdeckung enthält. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Entnehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Überstandsmaterial ab. Fügen Sie dann je etwa ein MOI des markierten Virus in einem Volumen von hundert Mikrolitern pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C.Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie die Zellen mit jeweils 0,5 Milliliter PBS-Puffer pro Mulde. Spülen Sie erneut und wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei Mal. Fixieren Sie die Zellen mit jeweils 200 Mikrolitern 3 % Pufferlösung pro Mulde bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Waschen Sie die Zellen dreimal mit je 0,5 Milliliter PBS-Puffer pro Mulde. Fixieren Sie die Zellen mit Fixierungslösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie den Deckel von der Mulde mit feinen Pinzetten.Überschüssige Flüssigkeit durch Vorsichtiges Ankippen der Deckglasränder ablaufen lassen. Gegen ein weißes Papier abtropfen lassen. Die Zellseite des Deckglases platzieren.Schlafen Sie 25 Mikroliter Dengue-E-Protein-Antikörper auf ein Stück Parfum. Inkubieren Sie eine Stunde lang in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Übertragen Sie danach den Deckel auf eine sechsbrügige Platte und geben Sie zwei Milliliter Waschpuffer pro Öl hinzu.Aspirieren Sie das Überstand. Wiederholen Sie diese Waschschritte noch zweimal nach dem letzten Waschgang. Entfernen Sie den Deckglaser mit feiner Pinzette aus der Vertiefung.Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Kante der Decke auf ein Papiertuch aufsetzen. Ziehen Sie sie leicht darüber, um sie abzutrocknen. Legen Sie die Decke mit der Zellseite nach unten auf.Schläfern Sie 25 µL Alexa unterhalb eines sekundären Antikörpers gegen Maus auf einem Stück Parfüm. Inkubieren Sie 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Nach Beendigung der Inkubation übertragen Sie den Deckgläser auf eine Sechs-Loch-Platte und waschen die Zellen dreimal mit je zwei mL Waschpuffer. Nach der letzten Waschung entfernen Sie den Deckträger aus dem Loch und spülen ihn einmal mit entionisiertem Wasser ab.Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie gegen ein Papier abstreifen. Geben Sie acht Mikroliter einer milden Montierlösung auf einen mikroskopischen Lichtabstand und setzen Sie die Deckglasabdeckung darauf. Lassen Sie die Montierlösung über Nacht bei vier Grad Celsius an der Luft aushärten.Die Probe ist nun bereit, mit einem Fluoreszenz- oder konfokalen Mikroskop visualisiert zu werden. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die Oberfläche des Deckgläschens und befestigen Sie es am Mikroskop. Platzieren Sie es auf dem Mikroskoptisch.Stellen Sie den Objekttisch so ein, bis die Mikroskop-Objektivspitze mit dem Immersionsöl in Kontakt kommt. Schalten Sie mit der Zes-Zen-Software die Umgebungsbeleuchtung aus, um ein klares Bild zu erhalten. Klicken Sie auf den Okular-Tab, um die Probe direkt durch das Okular des Mikroskops zu beobachten.Suchen Sie eine Kammer mit Zellen und stellen Sie den Fokus ein. Wechseln Sie nun in den Aufnahmemodus. Um Übersprechen zwischen den Fluoreszenzfarbstoffen zu minimieren, wählen Sie separate Kanäle für Alexa Fluor 488 und Finite Four.Verwenden Sie Farbstoffe und stellen Sie die Aufnahmesequenz auf sequenzielle Anregung und Detektion ein. Passen Sie die Laserleistung, den Verstärkungsfaktor und den Offset an, um sicherzustellen, dass die Aufnahme weder über- noch unterbelichtet ist. Nehmen Sie die Aufnahme auf und analysieren Sie einen interessierenden Bereich mithilfe der Kollokalisierungsfunktion.Der Überlappungskoeffizient kann verwendet werden, um den Markierungsgrad des Dengue-Virus durch die Alexa-Fluor-Farbstoffe zu schätzen. Ein einfacher Immunfluoreszenztest wurde an Viruszellen durchgeführt, und der Markierungsgrad kann aus der Kolokalisation des markierten Virus mit Anti-E-Protein-, Anti-Antikörper-Färbung abgeleitet werden. Die Werte des Überlappungskoeffizienten liegen zwischen 0,65 und 0,8, was darauf hindeutet, dass ungefähr 65 bis 80 % der Partikel mit dem Alexa-Fluor-Farbstoff markiert wurden. Damit die Markierung erfolgreich ist, ist es wichtig, den Markierungspuffer frisch herzustellen, sofort mit der Prozedur zu beginnen und den Alexa-Fluor-Diglykol vor der Markierung neu zu rekonstituieren.Die zu verwendende Farbstoffkonzentration kann weiter optimiert werden, um Ihren Anforderungen gerecht zu werden. Diese Methode der Horizont-Markierung von Dengue-Virus könnte möglicherweise angepasst werden, um andere Viren zu markieren. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Markierungsversuch.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Hier präsentieren wir eine empfindliche, schnelle und diskriminierende Post-Gel-Färbungsmethode, um RNAs mit RNA Mango Aptamern I, II, III oder IV abzubilden, wobei entweder native oder denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelverwendet werden. Nach dem Ausführen von Standard-PAGE-Gelen kann Mango-markierte RNA leicht mit TO1-Biotin gefärbt und dann mit allgemein verfügbaren Fluoreszenzlesern analysiert werden.

Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

Lernen Sie die Fluoreszenzmarkierung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor zur mikroskopischen Analyse. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung früher Virus-Wirt-Zell-Interaktionen.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

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