Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling
9. Juli 2011
Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, das Dengue-Virus für mikroskopische Untersuchungen fluoreszenzmarkiert darzustellen. Bereiten Sie die notwendigen Puffer vor und reinigen Sie das Dengue-Virus mithilfe eines Saccharosepolsters. Rekonstituieren Sie den Amy React Alexa Fluor Farbstoff und das Dengue-Virus im Markierungspuffer. Markieren Sie das Dengue-Virus mit hundert Mikromolar Alexa Fluor.
Incubieren Sie eine Stunde lang und stoppen Sie die Markierungsreaktion mit dem Sub-Reagenz. Reinigen Sie das markierte Denguevirus über eine Größenausschluss-Säule. Bestimmen Sie die neue Virus-Titer mittels Plaque-Assay und schätzen Sie den Markierungsgrad mittels Immunfluoreszenz-Assay.
Hallo, ich bin Sam Jang vom DSO National Laboratories und arbeite im Labor von Dr. Wee im Programm für neu auftretende Infektionskrankheiten nach dem Abschluss der medizinischen Fakultät der NUS. Heute zeige ich Ihnen, wie man Denki-Virus mit einem Amyl-reactiven Alexa-Fluor-Farbstoff fluoreszenzmarkiert, um bildgebende Untersuchungen durchzuführen. Alexa-Fluor-Farbstoffe weisen eine höhere Stabilität auf und sind weniger pH-empfindlich als herkömmliche Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin, wodurch sie sich ideal für Studien zum zellulären Uptake und zum endosomalen Transport des Virus eignen.
Mit einem Alexa-Fluor-markierten Dengue-Virus wird das Verständnis der Dengue-Pathogenese erleichtert. Beginnen wir also. Vor der Markierungsreaktion bereiten Sie frisch den Markierungspuffer und das Stoppreagenz gemäß dem schriftlichen Protokoll vor und reinigen Sie das Dengue-Virus mittels Saccharose-Cushion. Geben Sie eine geeignete Menge des gereinigten Dengue-Virus in Markierungspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Konzentration von 300 Millionen infektiösen Einheiten pro Milliliter zu erreichen.
Dies kann proportional vergrößert werden, um eine Chargenmarkierung des Virus durchzuführen. Lösen Sie den lyophilisierten Alexa-Fluordye unmittelbar vor der Markierungsreaktion in Markierungspuffer auf eine Konzentration von einem Millimolar auf.
Ab diesem Schritt die Belichtung durch Licht minimieren. Zu Demonstrationszwecken wird der Alexa-Fluoreszenzfarbstoff unbeleuchtetsschutz belassen. 800 Mikroliter der einmillimolaren Alexa-Fluoreszenzfarbstofflösung zu dem verdünnten Denguevirus geben, während leicht mit der Mikropipettenspitze gerührt wird.
Einmal stundenlang bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen mischen, dabei vor Licht geschützt halten. Nach einer Stunde die Röhrchen kurz zentrifugieren. 800 Mikroliter der Unterfraktion entnehmen, dabei vorsichtig mit der Mikropipette mischen, und weitere eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, dabei vor Licht geschützt halten und alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen mischen.
Unterdessen equilibrieren Sie die Reinigungssäule mit 25 Milliliter HNE-Puffer. Nach der einstündigen Inkubation wird das markierte Virus auf die Säule aufgetragen und der Durchlauf gesammelt. Füllen Sie die Säule mit HNE-Puffer auf.
Sobald das gesamte markierte Virus in die Matrix eingetreten ist, entsorgen Sie die ersten 2,5 Milliliter des Durchflusses und sammeln die nächsten zwei Milliliter der markierten Virusfraktion. Ecor und lagern Sie das gereinigte, markierte Virus bei Minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie den Titer des markierten Virus mittels Plaque-Assay.
In einem typischen Experiment sollte ein geringerer als zehnfacher Abfall der Virus-Titers beobachtet werden. Nach der Markierung sollte ein Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um den Grad der Markierung zu bewerten. Dazu zählen Sie die viralen Zellen mithilfe eines Hämozytometers und geben ein geeignetes Volumen an Zellen in das Wachstumsmedium, um eine Dichte von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Geben Sie je ein Milliliter viraler Zellen pro Vertiefung in eine Vier-Vertiefungs-Platte, die eine sterile Glasabdeckung enthält. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Entnehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Überstandsmaterial ab. Fügen Sie dann je etwa ein MOI des markierten Virus in einem Volumen von hundert Mikrolitern pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C.
Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie die Zellen mit jeweils 0,5 Milliliter PBS-Puffer pro Mulde. Spülen Sie erneut und wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei Mal. Fixieren Sie die Zellen mit jeweils 200 Mikrolitern 3 % Pufferlösung pro Mulde bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit je 0,5 Milliliter PBS-Puffer pro Mulde. Fixieren Sie die Zellen mit Fixierungslösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie den Deckel von der Mulde mit feinen Pinzetten.
Überschüssige Flüssigkeit durch Vorsichtiges Ankippen der Deckglasränder ablaufen lassen. Gegen ein weißes Papier abtropfen lassen. Die Zellseite des Deckglases platzieren.
Schlafen Sie 25 Mikroliter Dengue-E-Protein-Antikörper auf ein Stück Parfum. Inkubieren Sie eine Stunde lang in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Übertragen Sie danach den Deckel auf eine sechsbrügige Platte und geben Sie zwei Milliliter Waschpuffer pro Öl hinzu.
Aspirieren Sie das Überstand. Wiederholen Sie diese Waschschritte noch zweimal nach dem letzten Waschgang. Entfernen Sie den Deckglaser mit feiner Pinzette aus der Vertiefung.
Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Kante der Decke auf ein Papiertuch aufsetzen. Ziehen Sie sie leicht darüber, um sie abzutrocknen. Legen Sie die Decke mit der Zellseite nach unten auf.
Schläfern Sie 25 µL Alexa unterhalb eines sekundären Antikörpers gegen Maus auf einem Stück Parfüm. Inkubieren Sie 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Nach Beendigung der Inkubation übertragen Sie den Deckgläser auf eine Sechs-Loch-Platte und waschen die Zellen dreimal mit je zwei mL Waschpuffer. Nach der letzten Waschung entfernen Sie den Deckträger aus dem Loch und spülen ihn einmal mit entionisiertem Wasser ab.
Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie gegen ein Papier abstreifen. Geben Sie acht Mikroliter einer milden Montierlösung auf einen mikroskopischen Lichtabstand und setzen Sie die Deckglasabdeckung darauf. Lassen Sie die Montierlösung über Nacht bei vier Grad Celsius an der Luft aushärten.
Die Probe ist nun bereit, mit einem Fluoreszenz- oder konfokalen Mikroskop visualisiert zu werden. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die Oberfläche des Deckgläschens und befestigen Sie es am Mikroskop. Platzieren Sie es auf dem Mikroskoptisch.
Stellen Sie den Objekttisch so ein, bis die Mikroskop-Objektivspitze mit dem Immersionsöl in Kontakt kommt. Schalten Sie mit der Zes-Zen-Software die Umgebungsbeleuchtung aus, um ein klares Bild zu erhalten. Klicken Sie auf den Okular-Tab, um die Probe direkt durch das Okular des Mikroskops zu beobachten.
Suchen Sie eine Kammer mit Zellen und stellen Sie den Fokus ein. Wechseln Sie nun in den Aufnahmemodus. Um Übersprechen zwischen den Fluoreszenzfarbstoffen zu minimieren, wählen Sie separate Kanäle für Alexa Fluor 488 und Finite Four.
Verwenden Sie Farbstoffe und stellen Sie die Aufnahmesequenz auf sequenzielle Anregung und Detektion ein. Passen Sie die Laserleistung, den Verstärkungsfaktor und den Offset an, um sicherzustellen, dass die Aufnahme weder über- noch unterbelichtet ist. Nehmen Sie die Aufnahme auf und analysieren Sie einen interessierenden Bereich mithilfe der Kollokalisierungsfunktion.
Der Überlappungskoeffizient kann verwendet werden, um den Markierungsgrad des Dengue-Virus durch die Alexa-Fluor-Farbstoffe zu schätzen. Ein einfacher Immunfluoreszenztest wurde an Viruszellen durchgeführt, und der Markierungsgrad kann aus der Kolokalisation des markierten Virus mit Anti-E-Protein-, Anti-Antikörper-Färbung abgeleitet werden. Die Werte des Überlappungskoeffizienten liegen zwischen 0,65 und 0,8, was darauf hindeutet, dass ungefähr 65 bis 80 % der Partikel mit dem Alexa-Fluor-Farbstoff markiert wurden. Damit die Markierung erfolgreich ist, ist es wichtig, den Markierungspuffer frisch herzustellen, sofort mit der Prozedur zu beginnen und den Alexa-Fluor-Diglykol vor der Markierung neu zu rekonstituieren.
Die zu verwendende Farbstoffkonzentration kann weiter optimiert werden, um Ihren Anforderungen gerecht zu werden. Diese Methode der Horizont-Markierung von Dengue-Virus könnte möglicherweise angepasst werden, um andere Viren zu markieren. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Markierungsversuch.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur fluoreszenzmarkierten Markierung des Dengue-Virus unter Verwendung von Alexa Fluor für die mikroskopische Analyse vor. Der Ansatz ermöglicht die Visualisierung früher Wechselwirkungen zwischen dem Virus und Wirtszellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Fluoreszenzmikroskopie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Dengue-Virus ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem.
- Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Virus und Zelle ist entscheidend für die Entwicklung antiviraler Strategien.
- Die fluoreszenzmarkierte Färbung verbessert die Visualisierung dieser Wechselwirkungen.
- Fortschritte in der Bildgebungstechnologie ermöglichen detaillierte Untersuchungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Markierung des Dengue-Virus.
- Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen Dengue-Virus und Wirtszellen.
- Verbesserung des Verständnisses der frühen Stadien der Virusinfektion.
Verwendete Methoden
- Herstellung der erforderlichen Puffer für die Markierung.
- Reinigung des Dengue-Virus mittels Saccharose-Cushion.
- Rekonstitution des Alexa Fluor-Farbstoffs im Markierpuffer.
- Markierung des Virus mit einer spezifischen Farbstoffkonzentration.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche fluoreszenzmarkierte Markierung des Dengue-Virus.
- Visualisierung von Virus-Zelle-Interaktionen unter dem Mikroskop.
- Beurteilung der Markierungseffizienz mittels Immunfluoreszenz-Assay.
- Neubestimmung der Titer des markierten Virus mittels Plaque-Assay.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet eine einfache und effektive Möglichkeit, das Dengue-Virus zu markieren.
- Die fluoreszenzmarkierte Markierung erleichtert die Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen.
- Diese Technik kann auf andere Virusstudien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die direkte fluoreszenzmarkierte Markierung von Dengue-Virus mit Alexa Fluor ermöglicht eine präzise Visualisierung der Virus-Zelle-Interaktionen und unterstützt mechanistische Studien in frühen Stadien der Infektionsforschung. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung und leitet translationsmedizinische Strategien für die Entwicklung von Antiviratika und Impfstoffen an. Die Verträglichkeit der Methode mit lebendem Virus und quantitativer Bildgebung unterstreicht ihren Wert entlang von Entdeckungs- und präklinischen Entscheidungspunkten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Mechanismen des Virus-Eintritts und der intrazellulären Transportwege in Wirtszellen.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Klärung früher Infektionsereignisse, die für die Pathogenese relevant sind.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Visualisierung markierter Virus-Wechselwirkungen.
- Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Testung nachgeschalteter therapeutischer Hypothesen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet einen standardisierten Ansatz zur Herstellung fluoreszenzmarkierter Viren für bildbasierte Assays.
- Gewährleistet die Reproduzierbarkeit und quantitative Beurteilung der Markierungseffizienz mittels Immunfluoreszenz- und Plaque-Assays.
- Ermöglicht eine skalierbare Chargenmarkierung, die für Plattformen im Hochdurchsatz-Screening geeignet ist.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkung antiviraler Substanzen auf den viralen Zelleintritt und den intrazellulären Transport.
Translationale und präklinische Forschung
- Passt zu krankheitsrelevanten Modellen, da die Virusinfektiosität nach der Markierung erhalten bleibt.
- Ermöglicht die kontinuierliche Übertragung von mechanistischen Erkenntnissen auf die präklinische Validierung von interventionsbasierten Strategien.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung durch quantitative bildgebende Auswertungen.
- Erleichtert die Abstimmung von Biomarkern durch Kolokalisierungsanalysen von viralen und zellulären Markern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Markierungsmethode ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert und unterstützt hypothesengetriebene Studien, die Entwicklung von Assays sowie translationsorientierte Forschung zur viralen Pathogenese.
- Entdeckungsbiologie: Verbessert das mechanistische Verständnis von Virus-Wirt-Wechselwirkungen durch direkte Visualisierung und quantitative Kolokalisation.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, markierte Viruspräparationen für bildbasierte Screening-Verfahren von antiviralen Kandidaten.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Überlappungskoeffizienten und Infektiositätstiter für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Erhält funktionstüchtige Viren für den Einsatz in zellulären Modellen, die krankheitsrelevant sind, sowie in Biomarker-Studien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein breit anwendbares Protokoll zur Markierung anderer umhüllter Viren in unterschiedlichen Forschungs- und Entwicklungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der frühen Virologieforschung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Markierung und Abbildung von Viren, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten und optimiert die Ressourcenallokation, indem eine robuste Zielvalidierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antiviralen Wirkstoffen und Impfstoffkandidaten basierend auf quantitativen Bildgebungsdaten.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Virologie, Fluoreszenzmikroskopie und quantitativen Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu hochwertigen Bildgebungssystemen und analytischer Software für Kolokalisationsstudien.
- Erfordert sorgfältige Pufferherstellung und sorgfältigen Umgang mit Farbstoffen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und Zytotoxizität zu minimieren.
- Anpassbar auf andere umhüllte Viren durch Optimierung des Protokolls für spezifische virale Systeme.
- Hängt von der Aufrechterhaltung der Virusviabilität und der Markierungseffizienz für nachgeschaltete Anwendungen ab.
