Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling
July 9th, 2011
Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, das Dengue-Virus für mikroskopische Studien fluoreszierend zu markieren. Bereiten Sie die erforderlichen Puffer vor und reinigen Sie das Dengue-Virus mit einem Saccharosekissen, rekonstituieren Sie den Amy React Alexa Flow-Farbstoff und das Dengue-Virus in einem Markierungspuffer. Beschriften Sie das Dengue-Virus mit hundert Mikromolaren Alexa-Flow.
Sterben Sie für eine Stunde und stoppen Sie die Markierungsreaktion mit dem Subreagenz. Bereinigen Sie die Bezeichnung Dengue-Virus durch eine Größenausschlussspalte. Retitrieren Sie das markierte Virus durch Plaque-Assay und schätzen Sie den Grad der Markierung durch Immunfluoreszenz-Assay.
Hallo, ich bin Sam Jang von den DSO National Laboratories und arbeite in Dr. Wees Labor im Programm für neu auftretende Infektionskrankheiten nach dem NUS-Graduiertenstudium an der medizinischen Fakultät. Heute zeige ich Ihnen, wie Sie das fluoreszenzmarkierte Denki-Virus mit dem Amy Reactive Alexa Grippefarbstoff für bildgebende Studien fluoreszieren können. Alexa, Grippe-Sterben, haben eine überlegene Stabilität und sind weniger pH-empfindlich als gängige Diäten wie Fluorescein und Pansen, was sie ideal für Studien zur zellulären Aufnahme und zum endosomalen Transport des Virus macht.
Der Alexa-Fehler mit der Bezeichnung Dengue-Virus wird das Verständnis der Dengue-Pathogenese erleichtern. Also lasst uns loslegen. Vor der Markierungsreaktion bereiten Sie einen frischen Markierungspuffer vor und stoppen Sie das Reagenz gemäß dem schriftlichen Protokoll und reinigen Sie das Dengue-Virus durch ein Saccharosekissen, fügen Sie dem Markierungspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen ein angemessenes Volumen des gereinigten Dengue-Virus hinzu, um eine Konzentration von 300 Millionen bildenden Einheiten pro Milliliter zu erreichen.
Dies kann proportional skaliert werden. Für die Chargenkennzeichnung von Viren. Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Alexa-Bodenfarbstoff kurz vor der Markierungsreaktion in einem Markierungspuffer zu einem Millimolar.
Minimieren Sie die Lichteinwirkung ab diesem Schritt. Zu Demonstrationszwecken wird die Alexa-Bodenfarbe ungeschützt vor Licht von 800 Mikrolitern des einen Millimolaren gelassen. Die Alexa lässt das verdünnte Dengue-Virus unter leichtem Rühren mit der Mikropipettenspitze zu
.Nacheiner Stunde eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt durch sanfte Inversionen inkubieren, alle 15 Minuten durchmischt, die Röhrchen kurz zentrifugieren. 800 Mikroliter der Subregion inkubieren bei sanftem Anstarren mit der Mikropipette für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Geschützt vor Licht erfolgt durch sanfte Umkehrhaltungen alle 15 Minuten.
Inzwischen setzt er die Reinigungssäule mit 25 Millilitern HNE-Puffer gleich. Wenden Sie nach der einstündigen Inkubation das markierte Virus auf die Säule an und beginnen Sie mit dem Sammeln des Durchflusses. Füllen Sie die Spalte mit HNE-Puffer.
Sobald das gesamte markierte Virus in die Matrix gelangt ist, verwerfen Sie die ersten 2,5 Milliliter des Durchflusses und sammeln Sie die nächsten zwei Milliliter der markierten Virusfraktion. Ecor und sah das gereinigte markierte Virus bei minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie den Titel des markierten Virus durch Plaque-Assay.
In einem typischen Experiment sollte ein weniger als zehnfacher Rückgang des Virustitels beobachtet werden. Nach der Markierung sollte ein Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um den Grad der Markierung zu bewerten. Um dies zu erreichen, werden virale Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und eines geeigneten Zellvolumens auf Wachstumsmedien aufgezählt, um eine Dichte von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.
Sehen Sie einen Milliliter Viruszellen pro Vertiefung in einer Vier-Well-Platte mit einer sterilen Glasabdeckung. Schlafen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie den Supinator aus den Zellen mit etwa einem MOI des markierten Virus in einem Volumen von hundert Mikrolitern für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern PBS-Puffer pro Vertiefung. Spirit dis und wiederhole diesen Vorgang noch zwei weitere Male. Fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern von 3% pro Well für mehrere Höhen pro Vertiefung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 Millilitern PBS-Puffer pro Vertiefung. Alisieren Sie die Zellen mit einer Lösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie den Bezug Schlaf gut mit einer feinen Pinzette.
Lassen Sie überschüssige Flüssigkeit ab, indem Sie den Rand der Abdeckung mit einem DP versehen. Schieben Sie es auf ein weißes Papier. Platzieren Sie die Zellenseite der Abdeckung.
Schlafen Sie auf 25 Mikrolitern Dengue-E-Protein-Antikörper auf einem Stück Parfum. Eine Stunde lang in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubieren. Übertragen Sie als Nächstes den Deckglas auf eine Platte mit sechs Vertiefungen und fügen Sie zwei Milliliter Waschpuffer pro Öl hinzu.
Aspirieren Sie das Supinat. Wiederholen Sie diese Waschschritte nach der letzten Wäsche noch zwei Mal. Entfernen Sie das Deckglas mit feinem fp aus der Vertiefung.
Lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, indem Sie den Rand des Deckels eintauchen. Schlüpfen Sie gegen ein Papiertuch. Platzieren Sie die Zellenseite der Abdeckung.
Schlafen Sie auf 25 Mikrolitern Alexa-Boden für acht acht Anti-Maus-Sekundärantikörper auf einem Stück Parfüm. Nach Beendigung der Inkubation 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren, den Bezug auf den Schlaf auf eine Sechs-Well-Platte legen und die Zellen dreimal mit zwei Millilitern Waschpuffer waschen. Für jede Wäsche nach der letzten Wäsche den Deckschoffer aus der Vertiefung nehmen und einmal im ionisierten Wasser spülen.
Lassen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, indem Sie sie gegen ein Papier tauchen. Wischen Sie den Deckglas mit acht Mikrolitern milder Eindecklösung auf eine Mikroskopleuchte auf. Lassen Sie die Einbettlösung über Nacht auf vier Grad Celsius einwirken.
Die Probe ist nun bereit, mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop sichtbar gemacht zu werden. Geben Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl auf die Oberfläche der Abdeckung, des Schlafes und befestigen Sie das Mikroskop. Schieben Sie auf den Mikroskoptisch.
Stellen Sie den Tisch so ein, dass das Mikroskopobjektiv mit dem Immersionsöl in Berührung kommt. Schalten Sie für ein klares Bild die Umgebungsbeleuchtung mit der Zes Zen-Software aus. Klicken Sie auf den Okularhahn, um die Probe direkt durch das Okular des Mikroskops zu betrachten.
Suchen Sie eine Füllung mit Zellen und passen Sie den Fokus an. Wechseln Sie nun in den Aufnahmemodus. Um das Übersprechen zwischen Blumenfällen zu minimieren, wählen Sie separate Spuren für Alexa Floor 4, 8, 8 und Finite Four.
Färbt und stellt Erfassungen auf sequentielle Anregung und Detektion ein. Passen Sie die Verstärkung und den Versatz der Laserleistung an, um sicherzustellen, dass das Bild nicht über- oder unterbelichtet wird. Erfassen Sie das Bild und analysieren Sie einen Interessenbereich mit der Kolokalisierungsfunktion.
Der Überlappungskoeffizient kann verwendet werden, um den Grad der Markierung des Dengue-Virus durch den Alexa Flo Farbstoff abzuschätzen. Ein einfacher Immunfluoreszenz-Assay wurde an viralen Zellen durchgeführt, und der Grad der Markierung kann aus der Kolokalisation des markierten Virus abgeschätzt werden. Bei Anti-E-Protein und Anti-Antikörper-Färbung überlappt sich der Koeffizient im Bereich von 0,65 bis 0,8, was darauf hindeutet, dass etwa 65 bis 80 % der Varianzen mit dem Alexa-Bodenfarbstoff markiert wurden. Damit der Etikettierungsvorgang erfolgreich ist, ist es wichtig, den Etikettierungspuffer vorzubereiten und vor der Etikettierung frisch zu wüten und den Alexa-Bodendigest zu rekonstituieren.
Die Konzentration des zu verwendenden Farbstoffs kann weiter optimiert werden, um Ihren Bedürfnissen gerecht zu werden. Diese Methode der Horizontmarkierung des Dengue-Virus kann möglicherweise angepasst werden, um andere Viren zu markieren. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück für Ihr Etikettierungsexperiment.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine Methode zur Fluoreszenzmarkierung von Dengue-Virus unter Verwendung von Alexa Fluor für die mikroskopische Analyse. Der Ansatz ermöglicht die Visualisierung früher Interaktionen zwischen dem Virus und den Wirtszellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Virologie
- Fluoreszenzmikroskopie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Dengue-Virus ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem.
- Das Verständnis von Virus-Zell-Interaktionen ist entscheidend für die Entwicklung von antiviralen Strategien.
- Fluoreszente Markierung verbessert die Visualisierung dieser Interaktionen.
- Fortschritte in der Bildgebungstechnologie ermöglichen detaillierte Studien.
Ziel der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Markierung von Dengue-Virus zu entwickeln.
- Die Interaktionen zwischen Dengue-Virus und Wirtszellen zu visualisieren.
- Das Verständnis der frühen Stadien viraler Infektionen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung der notwendigen Puffer für die Markierung.
- Reinigung des Dengue-Virus mittels Saccharose-Kissen.
- Rekonstitution des Alexa Fluor-Farbstoffs im Markierungspuffer.
- Markierung des Virus mit einer spezifischen Konzentration des Farbstoffs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche fluoreszente Markierung von Dengue-Virus.
- Visualisierung der Virus-Zell-Interaktionen unter dem Mikroskop.
- Bewertung der Markierungseffizienz durch Immunfluoreszenz-Assay.
- Retitration des markierten Virus mittels Plaque-Assay.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet eine einfache und effektive Möglichkeit, Dengue-Virus zu markieren.
- Fluoreszente Markierung unterstützt die Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen.
- Diese Technik kann auf andere virale Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
