DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die DNA-Methylierungsanalyse von CPG-Dinukleotiden durch Genomsequenzierung von durch Sulfit umgewandelter DNA zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die doppelsträngige DNA denaturiert wird, so dass die Bisulfit-Umwandlungsreaktion stattfinden kann. Der zweite Schritt besteht darin, alle unmethylierten Cytosine in der genomischen DNA durch Bi-Sulfit-Desaminierung in Uracil umzuwandeln.

Diese Reaktion besteht aus drei Phasen. Die erste ist die Sulfatierung des Cytosinrests durch Zugabe von B-Sulfit zu der Fünf-Sechs-Doppel-Bindung. Zweitens erzeugt die hydraulische Desaminierung des Cytosins durch Sulfitderivat ein SSL durch Sulfitderivat, und drittens führt die Entfernung der Sulfonatgruppe durch Alkalibehandlung zu einem SSL-Rest.

Als nächstes wird die Zielregion durch bi-Sulfit-umwandlungsspezifische Primer und PCR-Amplifikation amplifiziert. Der letzte Schritt ist die Klonierung und Sequenzierung des PCR-Produkts, um eine Einzelnukleotidauflösung für die Methylierung über das DNA-Molekül zu erhalten. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die DNA-Methylierung von CPG-Dinukleotiden in genomischer DNA durch Ausnutzung der erhöhten Empfindlichkeit von Zytokinen gegenüber fünf Methylcytosin gegenüber der Bisulfat-Desaminierung unter sauren Bedingungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der südlichen Blutanalyse besteht darin, dass sie die Auflösung der d-Methylierung in Einzelnukleotiden ermöglichen kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. die Rolle der DNA-Methylierung bei menschlichen Krankheiten wie Krebs. Um DNA-Proben für die Bi-Sulfit-Umwandlung vorzubereiten, inkubieren Sie zunächst zwei Mikrogramm genomischer DNA mit Bi-Sulfit, DNA-Lysepuffer und einem Gesamtvolumen von 18 Mikrolitern für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Denaturieren Sie dann die genomische DNA, indem Sie zwei Mikroliter frisch zubereitetes dreimolares Natriumhydroxid zu einer Endkonzentration von 0,3 molar hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation bei 90 Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen in einem Wärmeblock sofort fünf Minuten lang auf Eis, zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang auf 10.000 G, um sicherzustellen, dass sich die DNA am Boden des Röhrchens befindet. Die denaturierten DNA-Proben sind nun bereit für die Desaminierung der B-Zell-Bekämpfung, die als nächstes demonstriert wird.

Vor der Sulfatierungs- und hydrolytischen Desaminierungsreaktion sind frische Lösungen aus 10 millimolaren Chinolen und gesättigtem Natriummeta durch Sulfit pH 5,0 herzustellen. Da das Natriummeta durch Sulfit eine gesättigte Lösung ist, können kleine Klumpen ungelöst bleiben. Fügen Sie das Natrium Meta by Sulfit 208 Mikroliter und Chinol 12 Mikroliter zur Denaturierungs-DNA 20 Mikroliter in einem Endvolumen von 240 Mikrolitern hinzu.

Wirbeln Sie die Röhrchen vor und zentrifugieren Sie sie 10 Sekunden lang, um sicherzustellen, dass sich alle Tröpfchen am Boden des Röhrchens befinden. Überlagern Sie die Proben mit Mineralöl. Inkubieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius in einem Wasserbad für vier bis 16 Stunden, abhängig von der Menge und Qualität der umzuwandelnden DNA.

Es ist wichtig, dass die Bisulfitumwandlung im Dunkeln stattfindet, um eine Oxidation zu vermeiden. Am Ende der entsprechenden Inkubationszeit drehen Sie die Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet. Pipettieren Sie dann vorsichtig die DNA-Lösung vom Boden des Röhrchens heraus, ohne das Mineralöl aufzunehmen.

Für die nächsten Schritte verwendet unser Labor das DNA-Aufreinigungssystem promega wizard. Geben Sie einen Milliliter Harz zu den DNA-Proben, drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um und pipettieren Sie die Lösung dann in eine Spritze, die an einer Entsalzungssäule befestigt ist. Um schließlich alle freien Bi-Sulfit-Ionen zu entfernen, führen Sie die mit Bi-Sulfit behandelte DNA durch die Entsalzungssäule und geben Sie 50 Mikroliter Milli Q-Wasser ein.

Der nächste Schritt besteht darin, den Bisulfit-Dachboden durch Entsalzung aus dem Uracilring zu entfernen. Um dies zu erreichen, fügen Sie jeder mit Bisulfit behandelten DNA-Probe 5,5 Mikroliter frisch zubereitetes Natriumhydroxid mit drei Molaren hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 Molar zu erhalten. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Zentrifugieren Sie die Proben kurz und fügen Sie dann jeder Probe einen Mikroliter TRNA hinzu. Neutralisieren Sie die Lösung, indem Sie Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von drei molaren hinzufügen. Als nächstes fällt Ethanol die DNA aus.

Eiskaltes, 100%iges Ethanol 330 Mikroliter hinzufügen und durch Inversion gut mischen. Eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius zentrifugieren lassen, um über Nacht bei 14.000 GS für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren. Entfernen Sie dann alle Spuren des Überstands und trocknen Sie die ausgefällte DNA etwa 20 Minuten lang an der Luft.

Nach dem Trocknen an der Luft ist es fast unmöglich zu sehen, wie das DNA-Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XTE oder Wasser resuspendiert wird. Lassen Sie es während dieser Zeit etwa zwei Stunden lang bei Raumtemperatur stehen, gelegentlich wirbeln Sie die Röhrchen durch, um sicherzustellen, dass die DNA aufgelöst wird, gefolgt von einer schnellen Zentrifuge. Sobald die DNA aufgelöst ist, kann sie je nach Menge und Qualität der DNA ein bis 10 Jahre bei minus 20 Grad Celsius gelagert oder sofort verwendet werden. Bei der PCR-Amplifikation ist die Primer-Optimierung der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.

Aus diesem Grund werden die folgenden Richtlinien bereitgestellt, um den Erfolg des Primer-Designs sicherzustellen. Zur Veranschaulichung dieser Richtlinien wurde die Zielsequenz durch Sulfit umgewandelt, so dass umgewandelte Cytosine beim Schreiben als blaue Ts und nicht umgesetzte CPG-Stellen als rote cgs erscheinen; Primer sollten 24 bis 30 Basenpaare lang sein, um die Spezifität zu gewährleisten. Primer sollten eine ähnlich vorhergesagte TM über 50 Grad Celsius aufweisen und sich nicht um mehr als ein bis zwei Grad Celsius unterscheiden.

Primer sollten mehrere C- bis T-Basen von ca. 25 % enthalten, um die Umwandlungsspezifität zu gewährleisten. Die endgültige Base, dass die drei Primzahlen ein C bis T sein sollten, um die Amplifikation von umgewandelten D-N-A-C-P-G-Dinukleotiden zu gewährleisten, sollte in der Primersequenz vermieden werden, um eine mögliche Verzerrung in Richtung methylierter, unmethylierter oder nicht umgesetzter Templates zu vermeiden. Falls dies jedoch unvermeidlich ist, sollte das Cytosin an der CPG-Stelle durch ein Y ersetzt werden, um eine unverzerrte Amplifikation der konvertierten DNA zu gewährleisten.

Entwerfen Sie schließlich verschachtelte oder halbverschachtelte Primer-Sets, um bei Bedarf die Spezifität oder Sensitivität der PCR-Reaktion sicherzustellen. Bereiten Sie PCR-Amplifikationsreaktionsgemische in 25-Mikroliter-Aliquoten zur Optimierung vor. Jede Reaktion enthält durch Sulfit umgewandelte genomische DNA, DPS-Primer, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Trishydrochlorid, pH 8,3 und Anac-Polymerase, um die Amplifikationsverzerrung von methyliertem oder unmethyliertem Material zu testen.

Verwenden Sie eine 50 50 methylierte, nicht methylierte, vollständig bi-sulfitkonvertierte Kontrollprobe, um auf eine proportionale PCR-Amplifikation mit Bi-Sulfit-Umwandlung zu testen. Spezifische Primer und PCR-Reaktionsmischung in einem Temperaturgradienten-Thermocycler stellen die Laufreaktion in einem Gradienten von plus oder minus drei Grad Celsius von der TM des Primers über acht bis 10 Röhrchen ein, wirbeln die Röhrchen und drehen sich kurz in einer Mikrozentrifuge, bevor sie in den Thermocycler gegeben werden. Diese Abbildung zeigt ein Agros-Gel mit einem Temperaturgradienten-PCR-Amplifikationsprofil aus einer Mischung von 50 % methylierter und unmethylierter DNA.

Die PCR-Amplikons und -Lanes, die mit den T-Lanen zwei, fünf und acht markiert sind, wurden mit einem Restriktionsenzym behandelt, das nur methylierte DNA verdaut. Optimale PCR-Amplifikationsbedingungen sollten methylierte und unmethylierte Amplikons proportional und ohne Verzerrung amplifizieren, was zu einer gleichen Menge an geschnittenem und ungeschnittenem PCR-Produkt führt, wie hier zu sehen. Die optimalen Thermocycling-Bedingungen für eine unverzerrte Vervielfältigung liegen bei 55,6 Grad Celsius. Die vollständige Umwandlung der Bi-Sulfit-DNA kann durch Verdau mit einem Cytosin-Standort-spezifischen Enzym analysiert werden, das nur die nicht umgewandelten DNA-Spuren drei, sechs und neun verdaut

Eine vollständige Bi-Sulfit-DNA-Umwandlung wird hier durch das Fehlen von geschnittener DNA in allen drei Spuren, den Spuren drei, sechs und neun, angezeigt. Dieses Echtzeit-Dissoziationsdiagramm zeigt einen gleichen Anteil an methylierter und unmethylierter DNA rot orange Linie 50 50 Mix im Vergleich zur Kontrollamplifikation von vollständig methylierter rosa Linie m und unmethylierter, grüner DNA Linie U, die bei 82,9 Grad Celsius bzw. 86,9 Grad Celsius dissoziieren. Dies deutet darauf hin, dass es keine Verstärkungsverzerrung gibt, die auf der Temperatur basiert, bei der die verschiedenen Moleküle dissoziieren.

Die resultierenden PCR-Fragmente aus der Amplifikation von Bi-Sulfit-behandelten Proben können mittels Agros-Gelelektrophorese visualisiert und sequenziert werden. Direkt dargestellt ist hier eine Sequenzspur von drei verschiedenen Zelllinien mit gelb hervorgehobenen CPG-Stellen. Linie X zeigt eine 100%ige Methylierung an allen drei CPG-Stellen, wobei die Zelllinien Y und Z unterschiedliche Methylierungsgrade aufweisen, wie durch überlappende GA-Signale zu sehen ist, die hier gezeigt werden. Abbildung 4 A ist eine Sequenzspur von drei verschiedenen Zelllinien, wobei die CPG-Stellen gelb hervorgehoben sind.

Nach direkter Sequenzierung einzelner Klone kann der Methylierungszustand der einzelnen Moleküle in einer Bi-Sulfit-Karte tabellarisch dargestellt werden. Um die Heterogenitätsmethylierung zu visualisieren, ist die Methylierungsdichte an einzelnen CPG-Stellen rot dargestellt. In dieser repräsentativen Bi-Sulfit-Karte wird die quantitative Methylierungsanalyse einer Probe mit hohem Durchsatz durchgeführt.

Unter Verwendung der Sequenom-Epityper-Technologie kann ein spezifisches Spektrum erzeugt werden, das vom Vorhandensein methylierter Cytosine abhängt, wie in diesem Beispiel gezeigt. Abbildung 5 A.Eine Zusammenfassung der Verhältnisse in der Probe kann dann in Form eines Epigramms extrapoliert werden. Abbildung fünf B. Dieses Beispiel zeigt den prozentualen Prozentsatz der DNA-Methylierung an jeder CPG-Stelle für vier verschiedene Zelllinien. Schließlich kann aus dem Epigramm Nach seiner Entwicklung eine Zusammenfassung des Methylierungsdiagramms Abbildung fünf C abgeleitet werden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, um die DNA-Methylierung und ihre Rolle bei menschlichen Krankheiten zu erforschen.