Name: DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Bisulfit-Modifikation zur DNA-Methylierungsanalyse mit Einzelnukleotid-Auflösung. Diese Methode ermöglicht präzise epigenetische Untersuchungen für Krebsforschung und Genregulation.

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Bisulfit Umwandlung Protokoll Ein Standardprotokoll für die Umwandlung von 2 ug genomische DNA wird nachfolgend beschrieben. Kleinere oder größere Mengen von genomischer DNA (100 pg-200 ug) kann auch Bisulfit erfolgreich behandelt werden. Diese Reaktionsbedingungen Ergebnis in vollständigem Umsatz (99,5 bis 99,7%) von fast allen Ziel-DNA-Sequenz 3. 1. DNA-Präparation Bereiten Sie Proben durch Inkubation genomischer DNA mit Bisulfit DNA Lysis Buffer (2 g t-RNA, 280 ng / ul Proteinase K, 1% SDS) in einem Gesamtvolumen von 18 ul für 1 Stunde bei 37 ° C. Hinweis: Dies ist wichtig, zu erreichen maximale Bisulfit Umwandlung, insbesondere mit DNA aus klinischen Proben, bei denen es noch Protein mit der DNA verbunden sein können, isoliert. 2. DNA Denaturierung <ol><li> Denaturieren 2 pg DNA in einem Volumen von 20 ul durch Zugabe von 2 ul frisch zubereitet 3M NaOH zu einer endgültigen conzentration von 0,3. </li><li> Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 15 min in einem Wasserbad, durch Inkubation bei 90 ° C folgte für 2 min in einem Heizblock. Anschließend wird der Röhrchen auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C für 10 s bei 10.000 g, um sicherzustellen, dass die DNA ist an der Unterseite des Rohres. </li></ol> 3. Bisulfit Desaminierung Sulfonierung &amp; Hydrolytische Desaminierung <ol><li> Bereiten Sie frische Lösungen von 10 mM Chinol und gesättigten Natriummetabisulfit pH 5,0 (7,6 g Na 2 S 2 O 5 mit 464 ul 10 M NaOH, aus bis zu 15 ml mit Wasser). Die Lösung von gesättigten Natriumbisulfit wird durch vorsichtiges Umdrehen des Reagenz / H 2 O-Gemisch erreicht, mit einem Minimum an Misch-und Entlüftung. Falls erforderlich, den pH-Wert mit 10 M NaOH, für die vollständige Auflösung der Metabisulfit Hinweis:. Da es sich um eine gesättigte Lösung ist, können kleine Klümpchen noch ungelöst. </li><li> Add 208ul der gesättigten Metabisulfit und 12 ul 10 mM Chinol die denaturierte DNA (20 ul), in einem Endvolumen von 240 ul bis zu einer Endkonzentration von 2,31 m bisulphite/0.5mM Chinol, pH 5,0. Vorsichtig mischen alle Reagenzien und Zentrifuge für 10 Sek. um sicherzustellen, dass alle der Tröpfchen sind an der Unterseite des Rohres. </li><li> Overlay die Proben mit 200 ul Mineralöl. Inkubieren Sie die Proben bei 55 ° C in einem Wasserbad, für 4-16 Stunden. Die Länge der Bisulfit-Behandlung ist abhängig von der Quantität und Qualität der DNA umgewandelt werden. Für die DNA von schlechter Qualität oder degradierte DNA, begrenzen die Inkubationszeit bis 4 Stunden. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Bisulfit-Konvertierung stattfindet in der Dunkelheit, um Oxidation zu vermeiden, so dass, wenn das nicht möglich ist wickeln Sie das Röhrchen in Folie vor der Inkubation . </li><li> Am Ende der entsprechenden Inkubationszeit, drehen Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge um sicherzustellen, dass alle Flüssigkeit am Boden des Röhrchens. </li><li> Recover der Bisulfit behandelte DNAunter der Ölschicht durch vorsichtiges Pipettieren die DNA-Lösung aus dem Boden des Röhrchens, ohne dabei irgendeine der Mineralöl. </li></ol> Entsalzung <ol start="5"><li> Entfernen Sie alle freien Bisulfitionen, indem sie durch eine Entsalzungssäule und Eluieren in 50 ul Milli-Q-Wasser (MQH 2 O). Je nach Menge und Qualität der genomischen DNA und wie es hergestellt wird, können verschiedene Entsalzungssäulen verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Promega Wizard Clean up Spalten, da diese Spalten geeignet zum Entfernen der SDS in der Vorbereitung der DNA verwendet vor der Umwandlung sind. </li></ol> Alkali Desulfonierung <ol start="6"><li> Die Bisulfit-Addukt wird aus dem Uracil Ring Desulfonierung entfernt. Desulphonate indem 5,5 ul frisch zubereitet 3M NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, dann inkubieren die Proben bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Kurz zentrifugieren und fügen 1 ul t-RNA (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; neutralisiert man die Lösung durch die Zugabe von 33 ul von Ammoniumacetat (NH 4 O Ac), pH 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 3M. <li> Ethanol-Fällung der DNA durch Zugabe von 330 ul eiskaltem 100% Ethanol, gut mischen durch Umdrehen. Leave at-20μC für 1 h bis über Nacht. Zentrifuge bei 14.000 g für 15 min bei 4 ° C. Entfernen Sie alle Spuren von Überstand und an der Luft trocknen die gefällte DNA für ~ 20 min. </li><li> Re-suspend das DNA-Pellet in 50 ul / ug von 0,1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) oder H 2 O. Lassen Sie bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden. Gelegentlich Wirbel der Rohre, um die DNA zu gewährleisten ist gelöst, gefolgt von einer schnellen Zentrifuge. </li><li> Verwenden Sie sofort für die PCR-Amplifikation, oder bei -20 ° C für 1-10 Jahre, je nach Menge und Qualität der DNA. </li></ol> 4. PCR-Amplifikation Primer Design <ol><li> Effektives Design von PCR-Bisulfit-Konvertierung-spezifische Primer ist Crucial dafür, dass effiziente, unvoreingenommene Verstärkung komplett konvertierter DNA auftritt. Die folgenden Richtlinien werden verwendet, um Primer-Design zu unterstützen. </li></ol> Primer Design Guidelines <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg"> Thermocyling <ol start="2"><li> Zur Prüfung auf proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter DNA, verwenden Sie einen 50:50 Methylated / Unmethylierte voll Bisulfit umgewandelt Kontrollprobe und verstärken mit der Bisulfit-Konvertierung-spezifische Primer unter den optimierten PCR-Reaktionsbedingungen (Abbildung 3). Für die 50:50 Methylated: Unmethylierte Kontrolle, in vitro Sssl methylierte DNA und entweder ganze Genom amplifiziert (WGA) DNA oder Vollblut DNA zu verwenden. Bitte beachten Sie, dass einige Gene natürlicherweise in Blut methyliert werden und daher in diesen Fällen ist es am besten, nur WGA DNA als "Unmethylierte" zu kontrollieren. </li><li> Bereiten PCR-Amplifikation Reaktionsmischungen in 100 &amp; mu; l Aliquots mit 2 ul der Bisulfit-konvertierte genomische DNA, 200 uM dNTPs, 1 uM Primer, 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 und 0,15 ul Taq-Polymerase. </li><li> In einem Temperaturgradienten Thermocycler, stellen Sie den Lauf-Reaktion in einem Gradienten + / - 3 ° C von der vorhergesagten Tm der Primer über 10 Tuben </li></ol><img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"><ol start="5"><li> Um zu testen, dass die methylierte und nicht methylierter Amplikons im Verhältnis wurden verstärkt, kann das Amplikon mit einer informativen Restriktionsenzym, wie Taq 1 (TCGA), dass methylierte DNA verdauen verdaut werden, aber nicht verdauen methylierter DNA, wenn die Restriktionsenzymstelle ist verändert nach Bisulfit-Konvertierung in TTGA. Das Ausmaß der Verdauung kann visualisiert werden durch Agarosegelelektrophorese (Abbildung 3A). Alternativ können SYBRGreen (0,2 ul von 1:1000 Verdünnung) der PCR-Reaktion hinzugefügt unddas Ausmaß der Methylierung kann durch Ausführen Wärme Dissoziation Grundstücke in einer real-time PCR Thermocycler (Abbildung 3B) beurteilt werden. </li><li> PCR Reaction Mix, MgCl 2-Konzentration und Thermocycling Bedingungen müssen möglicherweise angepasst werden, um PCR-Effizienz zu erhöhen oder proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter PCR-Fragmente zu gewährleisten. </li><li> Nachdem die PCR-Bedingungen optimiert sind, kann die PCR-Amplifikation von Bisulfit-konvertierte Proben durchgeführt werden. Hinweis: Sobald die Tm ist optimiert einem Temperaturgradienten PCR müssen nicht verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für Bisulfit-PCR-Amplifikation Optimierung ist in Abbildung 3 dargestellt. Optimal PCR-Amplifikation Bedingungen sollten methylierter und nicht methylierter Amplikons in Proportion und ohne Vorurteile zu verstärken. 3A zeigt ein Agarosegel mit einem Temperaturgradienten PCR-Amplifikation Profil aus einer Mischung von 50% methylierter und nicht methylierter DNA. The PCR-Produkte wurden mit einem Restriktionsenzym, Taq 1 (TCGA), dass methylierte verdauen (M) DNA behandelt worden, aber nicht (U) DNA methyliert verdauen als Restriktionsenzymstelle von Bisulfit-Konvertierung in TTGA verändert wird. Eine gleiche Menge geschnittenen und ungeschnittenen PCR-Produkt ist zu erwarten, wenn methylierte und nicht methylierter DNA im Verhältnis verstärkt wird. Es kann auf diesem Gel zu erkennen, dass die optimale thermocyling Bedingungen für nicht-Bias-Amplifikation Mit 56,1 ° C (T). Vollständige Umsetzung der Bisulfit-DNA kann auch durch Vergärung mit Cytosin-Ort-spezifische Enzym wie Hpa III (CCGG) analysiert werden. Hpa III wird nur verdauen, wenn die Konvertierung ist fehlgeschlagen, da die Restriktionsstelle gepflegt werden. Wenn die Konvertierung abgeschlossen ist die Restriktionsstelle wird TCGG oder TTGG je nach Methylierungsstatus der DNA umgewandelt werden. Komplette Bisulfit DNA Konvertierung kann in Abbildung 3A (H) zu sehen. 3B zeigt ein Echtzeit-Dissoziation Plot,kann auch als ein Werkzeug, um festzustellen, ob es irgendeine Verstärkung Bias auf die Temperatur, bei der die verschiedenen Moleküle distanzieren Basis verwendet werden. In dieser Figur ist ersichtlich, dass die PCR wurde verstärkt methyliert (M) und nicht methylierter (U) DNA im Verhältnis von einer Mischung aus 50% methylierter und nicht methylierter DNA im Vergleich zur Kontrollgruppe Amplifikation von voll methylierter und nicht methylierter DNA, die bei 82.1μC distanzieren werden und 78.9μC jeweils. Nach der Optimierung der thermocyling und Reaktionsbedingungen Bisulfit behandelten Proben können mit spezifischen Strang und Bisulfit-spezifischen Primern in einem Einzel-oder halb verschachtelte PCR-Reaktion amplifiziert werden. Das resultierende PCR-Fragmente können sichtbar gemacht werden durch Agarosegelelektrophorese und sequenziert entweder direkt (Abbildung 4A) oder durch Klonierung und Sequenzierung. Nach Klonierung und Sequenzierung der Methylierungsstatus der einzelnen Moleküle können in Tabellenform ausgegeben werden, in einer Bisulfit-Karte (Abbildung 4B), der Heterogenität der VisualisierungMethylierung. Hoher Durchsatz quantitative Methylierungsanalyse kann vorgeformten Einsatz von Technologie, wie sie von der Sequenom EpiTYPER Methode genutzt werden. Mit dieser Methode ist Bisulfit-konvertierter DNA mit Bisulfit spezifischen PCR amplifiziert und gefolgt von einem proprietry Spaltung Prozess. Die resultierenden Fragmente werden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie mit dem spezifischen Spektrum abhängig von der Anwesenheit von methylierter Cytosine (Abbildung 5A) quantifiziert. Eine Zusammenfassung der Methylierung Verhältnisse in der Probe kann dann in Form von einem Epigramm (Abbildung 5B) oder Methylierung Plot (Abbildung 5C) extrapoliert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Methylierte CpG schematisch. In der normalen Zelle, Promotor-assoziierten CpG-Inseln sind überwiegend nicht methylierter (grau), während CpG sites innerhalb Gen Körper spärlich und meist methyliert (rot) sind. Das Panel auf der rechten Seite erweitert die molekulare StrukturAbbildung der DNA an einer einzelnen CpG Website und zeigt Methylierung mit einer CH3-Molekül auf Kohlenstoff 5 von Cytosin. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. . Chemische Umwandlung schematische Analyse der DNA-Methylierung beinhaltet vier Stufen, wie gezeigt, Denaturierung, Bisulfit-Konvertierung, PCR-Amplifikation und-analyse. In der rechten Seite, sind Änderungen an den Cytosin-Molekül, das während der Bisulfit-Konvertierung auftreten dargestellt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Optimierung der PCR-Amplifikation. A. Agarosegelelektrophorese mit einem Temperaturgradienten PCR-Amplifikation Profil aus einer Mischung von 50% methylierter und nicht methylierter DNA. Fragmente wurden entweder mit Taq1 (T) oder HpaIII (H), die methylierte DNA und nicht Bisulfit-konvertierter DNA bzw. zu verdauen verdaut worden. B. Wärme Dissoziationskurve Analyse zeigt eine Gleichungl Anteil von methylierter und nicht methylierter DNA (rote Linie 50/50 Mischung), um die Regelverstärkung von permethylierten (rosa Linie, M) und nicht methylierter DNA (grüne Linie, U), die bei 82,1 ° C und 78,9 ° C bzw. distanzieren verglichen. <img alt="Abbildung 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4a"> <img alt="Abbildung 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4b"> Abbildung 4. Beispiel für die direkte Sequenzierung und eine Bisulfit-Karte. A. Sequence Spur von drei verschiedenen Zelllinien mit CpG sites in gelb hervorgehoben. Zell-Linie X zeigt 100% Methylierung an allen drei CpG während Zelllinien Y und Z unterschiedlichem Ausmaß der Methylierung als durch überlappende G / A-Signale erkennen zu zeigen. B. Repräsentative Bisulfit Karte zeigt die Dichte der Methylierung (rote Punkte) an den einzelnen CpG sites, wie durch direkte Sequenzierung der einzelnen Klone bestimmt. <img alt="Abbildung 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5a"> Abbildung 5. Hochdurchsatz DNA-Methylierungs-Analyse mit Sequenom. A. Spectrum Ansicht mit Sequenom epiTYPER Technologie. DNA-Fragmente Display spezifische Spektren, je nach Menge der DNA-Methylierung zu präsentieren. B. Epigram Zusammenfassung der Anteil der DNA-Methylierung bei jedem CpG site für vier verschiedene Zelllinien. C. Methylierung Inhaltsangabe aus dem Sequenom Epigram abgeleitet.

<ol><li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+genomic+sequencing%3A+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li>
<li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

DNA-Methylierung Analyse durch Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA ist ein gut etabliertes und vielseitige Methode, dass die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung ermöglicht. Allerdings stützt sich Bisulfit Umwandlung und anschließende Analyse auf der Prämisse, dass die DNA wurde vollständig mit allen methylierten Cytosin wird in Uracil deaminiert und nur methylierte Cytosine verbleibenden un-reaktive umgewandelt. Wenn die Konvertierung nicht vollständig ist, können Probleme mit der Analyse ergeben sich da nicht umgesetzte unmethylierte Cytosine kann fälschlicherweise als methylierte Cytosine interpretiert werden. Bisulfit Umwandlung kann in verschiedenen Phasen optimiert werden, um den Prozentsatz der Umwandlung zu maximieren. Für die DNA vollständig umgestellt werden sie zuerst muss einzelsträngige, so dass Cytosinresten der Bisulfit-Ionen ausgesetzt sind. Der erste Schritt, DNA-Denaturierung, ist kritisch und kann die Quelle der unvollständigen Umwandlung werden, wenn die DNA nicht vollständig denaturiert. Um zu gewährleisten,dass die DNA vollständig denaturiert wird, ist es wichtig, dass die Reaktion Parameter einschließlich Entfernung aller assoziierten Protein, geeignete Salzkonzentration, Inkubationstemperatur und geeignet ist, um DNA in einzelsträngige Konformation zu halten sind. Es ist wichtig, an die frische 3M NaOH verwenden und für eine angemessene Inkubationszeit ermöglichen. Wenn die DNA widersteht Denaturierung, können einige Modifikationen, um das Protokoll einschließlich der Ausweitung des Inkubationszeit auf 30 Minuten oder Fragmentierung der DNA vor der Denaturierung zu erleichtern DNA-Denaturierung. Darüber hinaus können Einzelstrang-DNA (ssDNA) re-Glühen zu DNA (dsDNA) während der Bisulfit-Konvertierung Reaktion zu verdoppeln. Durchführung der Reaktion bei einer höheren Temperatur (90-95 ° C) entweder periodisch oder kontinuierlich während der Bisulfit-Reaktion kann Hilfe der Aufrechterhaltung der ssDNA. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass DNA-Abbau stark bei diesen höheren Temperaturen beschleunigt. Verschiedene Reagenzien können ebenfalls hinzugefügt, um re-Glühen von th stören werdene DNA-Stränge, wie Harnstoff. Die Konzentration von DNA und deren Qualität kann auch Auswirkungen auf die Effizienz der Bisulfit-Reaktion und ultimative PCR-Ausbeute. DNA-Abbau ist eine Einschränkung der Bisulfit-Konvertierung Protokoll. Die chemische Behandlung der DNA werden verschiedene Brüche in ssDNA und einige der harten Bedingungen, die für komplette Bisulfit Konversion einschließlich High Bisulfit-Konzentration, lange Inkubationszeiten können DNA-Abbau zu beschleunigen. Unter dem Standard-Reaktionsbedingungen beschrieben, ist die DNA-Abbau nicht ein allgemeines Problem jedoch, wenn Protokoll Änderungen eingeführt werden, wie Sequenzen, die refraktär auf Umwandlung sind, für die DNA-Templates, die abgebaut oder von schlechter Qualität, wie FFPE Proben werden dann DNA-Abbau kann eine erhebliche Einschränkung geworden. Formalin fixiert, in Paraffin eingebetteten (FFPE) und degradierte DNA-Proben werden effektiv umgewandelt und verstärkt Bisulfit mit diesem ProtokollAber Änderungen, um sicherzustellen, dass die DNA nicht weiter abgebaut werden empfohlen. Die Verwendung eines Trägers RNA, wie t-RNA wird empfohlen. Auch Glykogen als Träger hinzugefügt werden, wenn DNA-Konzentration ist gering (&lt;200 ng). Da DNA aus FFPE Geweben isoliert ist bereits fragmentiert und weitere Fragmentierung erfolgt bei Desaminierung, muss darauf geachtet werden weitere Abbau zu minimieren. Nicht-Fragment DNA weiter vor Denaturierung und begrenzen die Inkubationszeit für die Bisulfit-Reaktion zu 4 Stunden. Design-Amplikons nicht größer als 300 bp durch fragmentierte DNA. Ein weiterer Faktor, PCR-Amplifikation beeinflussen können, dass Bisulfit Umwandlung von nicht methylierten Cytosin die Komplexität der DNA-Vorlage reduziert. Die folgenden Primer-Design-Protokoll in Abschnitt 4.1, erhöhte Primer Länge und nested PCR beschrieben können alle dazu beitragen, Spezifität und PCR Ausbeute zu erhöhen. Schließlich ist da die DNA-Vorlage in bisulph verändertite Wandlung, Verstärkung Bias kann ein Problem sein. Stellen Sie sicher, dass proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter Vorlagen mit einer Kontrollgruppe 50/50 M / U DNA-Mix wird überprüft, wie im Protokoll beschrieben, siehe Abbildung 3. Stellen Sie außerdem sicher, dass Amplifikation nur umgewandelt Vorlagen auftritt mit HpaIII Restriktionsenzym und Gelelektrophorese (Abbildung 3). Die PCR-Bedingungen müssen möglicherweise durch Variation der Temperatur und / oder Magnesium-Konzentration oder Verlängerung Erweiterung optimiert werden. Einige Vorlagen werden als besonders problematisch und Primer-Position kann angepasst werden müssen oder degenerierte Primer können verwendet werden müssen. Next Generation Sequencing-Techniken entwickeln sich rasant zu einer ähnlichen Auflösung zu erreichen, um genomische Sequenzierung Bisulfit und dritten Generation Einzelmolekül-Sequenzierung hat das Potenzial, für die Analyse von sowohl primärer DNA-Methylierung und ohne die Notwendigkeit für Bisulfit-Sequenzierung zu ermöglichen. Doch weit verbreitete Verfügbarkeit und specificity dieser Techniken noch einige Zeit weg. Bisulfit-Sequenzierung genomischer ist der Goldstandard in der Methylierungsanalyse und ist ein robustes Protokoll. Das Verfahren wurde bis zu dem Punkt, wo die gemeinsamen Probleme und Einschränkungen gelöst haben Fortschritte gemacht und die Anwendungen von einzelnen Gen-Analysen mit hohem Durchsatz und ganze Genom-Analyse von Clark et al erweitert. 2006 4. Troubleshooting-Richtlinien und weitere Empfehlungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Es wird vorgeschlagen, dass die optimale Vorgehensweise, zunächst folgen Sie den Standard-Protokoll und nur vorstellen Modifikation, ob und wann ein Problem auftaucht ist. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabelle 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 2"> Tabelle 1. Richtlinien für die Problembehebung

<ol><li> Natriummetabisulfit (Ajax Finechem) </li><li> Hydrochinon (Merck) </li><li> Wizard DNA-clean-up System (Promega) </li></ol>

dna-methylierung: bisulfit modifikation und analyse

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetik beschreibt die vererbbare Veränderungen in der Gen-Funktion, die unabhängig voneinander auftreten, um die DNA-Sequenz. Die molekulare Grundlage der epigenetischen Genregulation ist komplex, aber im Wesentlichen um Modifikationen an der DNA selbst oder die Proteine, mit denen DNA assoziiert. Der überwiegende epigenetische Veränderung der DNA in Säugetier-Genomen ist die Methylierung von Cytosin Nukleotide (5-MeC). DNA-Methylierung enthält Anweisungen, um die Genexpression Maschinen wie, wo und wann das Gen ausgedrückt werden sollte. Das primäre Ziel-Sequenz für die DNA-Methylierung in Säugetieren ist 5&#39;-CpG-3 &#39;-Dinukleotide (Abbildung 1). CpG-Dinukleotide sind nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, sondern sind in Regionen repetitive genomische Sequenzen und CpG &quot;Inseln&quot; gewöhnlich mit Gen-Promotoren (Abbildung 1) assoziiert konzentriert. DNA-Methylierungsmuster sind früh in der Entwicklung, gegründet moduliert und im Gewebe spezifische Differenzierung gestört in vielen Erkrankungen wie Krebs. Um understand die biologische Rolle von DNA-Methylierung und deren Rolle in der menschlichen Krankheit, präzise, ​​effiziente und reproduzierbare Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von einzelnen 5-MECs. Das Protokoll für die Bisulfit-Konvertierung ist der &quot;Goldstandard&quot; für die DNA-Methylierung und erleichtert die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung. Die Chemie der Cytosin-Desaminierung von Natriumbisulfit in drei Schritten (Abbildung 2). (1) Sulfonierung: Der Zusatz von Bisulfit an die 5-6 Doppelbindung von Cytosin (2) Hydrolic Desaminierung: hydrolytische Desaminierung der resultierenden Cytosin-Bisulfit-Derivat geben einen Uracil-Bisulfit-Derivat (3) Alkali Desulfonierung: Die Entfernung der Sulfonat Gruppe durch eine Alkalibehandlung zu Uracil. Bisulfit bevorzugt desaminiert Cytosin zu Uracil in Einzelstrang-DNA, während die 5-MeC ist refraktär gegenüber Bisulfit-vermittelte Desaminierung. Nach PCR-Amplifikation ist Uracil verstärktwie Thymin, während 5-MeC Rückstände als Cytosine bleiben, so dass methylierte CpG von methylierter CpG durch Vorhandensein eines Cytosin &quot;C&quot; versus Thymin &quot;T&quot;-Rest werden während der Sequenzierung aus. DNA-Modifikation durch Bisulfit-Konvertierung ist ein gut etabliertes Protokoll, das für viele Methoden der DNA-Methylierung Analyse genutzt werden können. Da der Nachweis von 5-MeC von Bisulfit-Konvertierung wurde zuerst von Frommer et al. 1 und Clark et al. 2, Methoden um Bisulfit-Konvertierung von genomischen DNA-Konto für die Mehrheit der neuen Daten auf Basis von DNA-Beweis gestellt. Verschiedene Methoden der post-PCR-Analyse kann verwendet werden, je nach dem Grad der Spezifität und Auflösung der Methylierung erforderlich. Klonierung und Sequenzierung ist immer noch die am leichtesten zugängliche Methode, die single nucleotide Auflösung für Methylierung der gesamten DNA-Molekül geben kann.

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Die Epigenetik beschreibt die vererbbaren Änderungen der Genfunktion, die unabhängig von der DNA-Sequenz auftreten. Die molekulare Basis der epigenetischen Gen...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-Methylierungsanalyse von CPG-Dinukleotiden durch genomische Sequenzierung von sulfitkonvertierter DNA zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die doppelsträngige DNA denaturiert wird, sodass die Bisulfit-Konvertierungsreaktion stattfinden kann. Der zweite Schritt besteht darin, alle unmethylierten Cytosine in der genomischen DNA durch Bisulfit-Desaminierung in Uracil umzuwandeln.Diese Reaktion umfasst drei Phasen. Die erste ist die Sulfatierung des Cytosinrests durch Zugabe von B-Sulfit an die Doppelbindung zwischen C5 und C6. Zweitens führt die hydrolytische Deaminierung des Cytosins durch ein Sulfitderivat zur Bildung eines SSL durch ein Sulfitderivat, und drittens bewirkt die Entfernung der Sulfonatgruppe durch alkalische Behandlung einen SSL-Rest.Anschließend wird der Zielbereich mittels primerspezifischer Bisulfitumwandlung und PCR-Amplifikation amplifiziert. Der letzte Schritt besteht im Klonen und Sequenzieren des PCR-Produkts, um eine Auflösung auf Ebene einzelner Nukleotide für die Methylierung entlang des DNA-Moleküls zu erhalten. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die DNA-Methylierung von CPG-Dinukleotiden in genomischer DNA auf, indem die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin gegenüber 5-Methylcytosin gegenüber Bisulfit-Desaminierung unter sauren Bedingungen ausgenutzt wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Southern-Blot-Analyse besteht darin, dass sie eine Auflösung der DNA-Methylierung auf Ebene einzelner Nukleotide ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, beispielsweise welche Rolle die DNA-Methylierung bei menschlichen Erkrankungen wie Krebs spielt. Um DNA-Proben für die Bisulfitumwandlung vorzubereiten, inkubieren Sie zunächst zwei Mikrogramm genomische DNA mit Bisulfit, DNA-Lysepuffer und einem Gesamtvolumen von 18 Mikrolitern eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Anschließend denaturieren Sie die genomische DNA, indem Sie zwei Mikroliter frisch zubereitete dreimolare Natronlauge hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,3 molaren zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad, gefolgt von einer Inkubation bei 90 Grad Celsius für zwei Minuten. Stellen Sie die Röhrchen danach sofort in einen Eisbad für fünf Minuten, zentrifugieren Sie sie für 10 Sekunden bei 10.000 G, um sicherzustellen, dass sich die DNA am Boden der Röhrchen befindet. Die denaturierten DNA-Proben sind nun bereit für die B-Zell-Fight-Deaminierung, die im nächsten Schritt demonstriert wird.Vor den Sulfatierungs- und hydrolytischen Deaminierungsreaktionen bereiten Sie frische Lösungen von 10 Millimolar Chinol und gesättigtem Natriummetabysulfit bei pH 5,0 vor. Da es sich bei Natriummetabysulfit um eine gesättigte Lösung handelt, können kleine Klumpen ungelöst bleiben. Geben Sie 208 Mikroliter Natriummetabysulfit und 12 Mikroliter Chinol zu 20 Mikrolitern denaturierter DNA in einem Endvolumen von 240 Mikrolitern hinzu.Vortexen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie für 10 Sekunden, um sicherzustellen, dass alle Tropfen am Boden des Röhrchens liegen. Überdecken Sie die Proben mit Mineralsöl. Inkubieren Sie die Proben je nach Menge und Qualität der zu konvertierenden DNA vier bis 16 Stunden lang bei 55 Grad Celsius in einem Wasserbad.Es ist wichtig, dass die Bisulfitumsetzung im Dunkeln erfolgt, um eine Oxidation zu vermeiden. Am Ende der geeigneten Inkubationszeit die Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet. Anschließend die DNA-Lösung vorsichtig vom Boden des Röhrchens abpipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein Mineralsöl mitaufgenommen wird.Für die nächsten Schritte verwendet unser Labor das Promega Wizard DNA-Reinigungssystem. Geben Sie ein Milliliter Harz zu den DNA-Proben hinzu, invertieren Sie das Gefäß zum Mischen und pipettieren Sie die Lösung in eine Spritze, die an eine Desalzierungssäule angeschlossen ist. Abschließend wird die bisulfitbehandelte DNA durch die Desalzierungssäule geleitet, um freie Bisulfit-Ionen zu entfernen, und mit 50 Mikrolitern Milli-Q-Wasser eluiert.Der nächste Schritt besteht darin, das Bisulfitaddukt vom Uracilring durch Desaminierung zu entfernen. Fügen Sie hierzu 5,5&nbsp;Mikroliter frisch zubereitete dreimolare Natronlauge zu jeder bisulfitbehandelten DNA-Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3&nbsp;molar zu erreichen. Anschließend werden die Proben 15&nbsp;Minuten bei 37&nbsp;Grad Celsius inkubiert.Zentrifugieren Sie die Proben kurz und geben Sie dann ein Mikroliter TRNA zu jeder Probe hinzu. Puffern Sie die Lösung durch Zugabe von Ammoniumacetat auf eine Endkonzentration von drei Molaren. Führen Sie anschließend eine Ethanolpräzipitation der DNA durch.Fügen Sie 330 Mikroliter eiskalte, 100 %igen Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen gut durch. Lassen Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius eine Stunde bis über Nacht stehen, anschließend zentrifugieren Sie bei 14.000 ×g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann sämtliche Spuren des Überstandes und lassen Sie die präzipitierte DNA für etwa 20 Minuten an der Luft trocknen.Nach dem Lufttrocknen ist das Pellet kaum sichtbar. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XTE oder Wasser und lassen Sie es etwa zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen. Vortexen Sie die Röhrchen gelegentlich, um sicherzustellen, dass die DNA vollständig gelöst wird, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation. Sobald die DNA gelöst ist, kann sie je nach Menge und Qualität ein bis zehn Jahre bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder sofort verwendet werden. Bei der PCR-Amplifikation ist die Primer-Optimierung der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.Daher werden die folgenden Richtlinien bereitgestellt, um eine erfolgreiche Primer-Designsicherheit zu gewährleisten. Um diese Richtlinien zu veranschaulichen, wurde die Zielsequenz durch Sulfit konvertiert, sodass konvertierte Cytosine beim Schreiben als blaue Ts erscheinen und nicht konvertierte CpG-Stellen als rote Cgs. Primer sollten 24 bis 30 Basenpaare lang sein, um Spezifität sicherzustellen. Primer sollten einen ähnlich vorhergesagten Tm-Wert über 50 Grad Celsius aufweisen und sich um nicht mehr als ein bis zwei Grad Celsius unterscheiden.Primer sollten mehrere Basen mit etwa 25 % C zu T enthalten, um die Konversionsspezifität sicherzustellen. Die letzte Base am 3'-Ende sollte eine C-zu-T-Base sein, um die Amplifikation konvertierter DNA-CpG-Dinukleotide zu gewährleisten. CpG-Dinukleotide sollten in der Primersequenz vermieden werden, um eine potenzielle Verzerrung zugunsten methylierter, unmethylierter oder nicht konvertierter Vorlagen zu vermeiden. Falls dies jedoch nicht vermeidbar ist, sollte das Cytosin an der CpG-Stelle durch ein Y ersetzt werden, um eine unverzerrte Amplifikation der konvertierten DNA sicherzustellen.Entwerfen Sie abschließend geschachtelte oder halbgeschachtelte Primer-Sets, um gegebenenfalls die Spezifität oder Empfindlichkeit der PCR-Reaktion sicherzustellen. Bereiten Sie die PCR-Amplifikationsreaktionsgemische in 25-Mikroliter-Aliquoten zur Optimierung vor. Jede Reaktion enthält sulfitzierungsveränderte genomische DNA, DPS-Primer, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Tris-Hydrochlorid (pH 8,3) und eine DNA-Polymerase, um eine Amplifikationsverzerrung für methyliertes oder unmethyliertes Material zu testen.Verwenden Sie eine 50:50-methylierte, nicht-methylierte, vollständig bisulfitkonvertierte Kontrollprobe, um die proportionale PCR-Amplifikation nach Bisulfitumwandlung zu testen. Verwenden Sie spezifische Primer und PCR-Reaktionsmix in einem Temperaturgradienten-Thermocycler, und stellen Sie die Reaktionsbedingungen in einem Gradienten von plus/minus drei Grad Celsius bezüglich der TM der Primer über acht bis zehn Reaktionsgefäße ein. Vortexen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie kurz in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie sie in den Thermocycler geben. Diese Abbildung zeigt ein Agarosegel mit einem Temperaturgradienten-PCR-Amplifikationsprofil aus einer Mischung aus 50 % methylierter und nicht-methylierter DNA.Die PCR-Amplicons und die mit T markierten Läufe zwei, fünf und acht wurden mit einem Restriktionsenzym behandelt, das nur methylierte DNA verdaut. Optimale PCR-Amplifikationsbedingungen sollten methylierte und unmethylierte Amplicons proportional und ohne Bias amplifizieren, was zu einer gleichen Menge an geschnittenen und ungeschnittenen PCR-Produkten führt, wie hier zu sehen ist. Die optimalen Thermocycling-Bedingungen für eine unverzerrte Amplifikation liegen bei 55,6 Grad Celsius. Die vollständige Konversion der Bisulfit-DNA kann durch Verdauung mit einem cytosinspezifischen Enzym analysiert werden, das nur nicht umgewandelte DNA verdaut, Läufe drei, sechs und neun.Eine vollständige Bisulfit-DNA-Umwandlung wird hier durch das Fehlen von geschnittener DNA in allen drei Bahnen, den Bahnen drei, sechs und neun, angezeigt. Diese Echtzeit-Dissociationskurve zeigt ein gleichmäßiges Verhältnis von methylierter und unmethylierter DNA – rostrote Linie, 50:50-Mischung – im Vergleich zur Kontrollvermehrung vollständig methylierter rosa Linie (m) und unmethylierter DNA grüne Linie (U), die bei 82,9 °C bzw. 86,9 °C dissoziieren. Dies zeigt, dass keine Amplifikationsverzerrung aufgrund der Temperatur vorliegt, bei der die unterschiedlichen Moleküle dissoziieren.Die resultierenden PCR-Fragmente aus der Amplifikation von bisulfitbehandelten Proben können mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht und sequenziert werden. Direkt dargestellt ist hier eine Sequenzablaufkurve aus drei verschiedenen Zelllinien, wobei die CPG-Stellen gelb hervorgehoben sind. Die Zelllinie X weist eine 100%ige Methylierung an allen drei CPG-Stellen auf, während die Zelllinien Y und Z unterschiedliche Grade der Methylierung zeigen, wie durch überlappende GA-Signale ersichtlich. Abbildung vier A ist eine Sequenzablaufkurve aus drei verschiedenen Zelllinien, wobei die CPG-Stellen gelb hervorgehoben sind.Nach der direkten Sequenzierung einzelner Klone können die Methylierungszustände der einzelnen Moleküle in einer Bisulfit-Karte erfasst werden. Um die heterogene Methylierung zu veranschaulichen, ist die Dichte der Methylierung an einzelnen CpG-Stellen in Rot dargestellt. In dieser repräsentativen Bisulfit-Karte erfolgt die hochdurchsatzfähige quantitative Methylierungsanalyse einer Probe.Mithilfe der Sequenome-Epi-Typer-Technologie kann ein spezifisches Spektrum erzeugt werden, das von der Anwesenheit methylierter Cytosine abhängt, wie in diesem Beispiel in Abbildung fünf A dargestellt. Eine Zusammenfassung der Verhältnisse in der Probe kann anschließend in Form einer Epigramm-Abbildung fünf B extrapoliert werden. Dieses Beispiel zeigt den Prozentsatz der DNA-Methylierung an jeder CPG-Stelle für vier verschiedene Zelllinien. Schließlich kann ein Zusammenfassungsdiagramm der Methylierung, Abbildung fünf C, aus dem Epigramm nach dessen Erstellung abgeleitet werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Epigenetik, um die DNA-Methylierung und ihre Rolle bei menschlichen Erkrankungen zu erforschen.

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Research

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Biology

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