DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-Methylierungsanalyse von CPG-Dinukleotiden durch genomische Sequenzierung von sulfitkonvertierter DNA zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die doppelsträngige DNA denaturiert wird, damit die Bisulfit-Konvertierungsreaktion stattfinden kann. Der zweite Schritt besteht darin, alle unmethylierten Cytosine in der genomischen DNA durch Bisulfit-Desaminierung in Uracil umzuwandeln.

Diese Reaktion umfasst drei Phasen. Die erste ist die Sulfatierung des Cytosinrests durch Zugabe von B-Sulfit an die Doppelbindung zwischen C5 und C6. Zweitens führt die hydrolytische Deaminierung des Cytosins durch ein Sulfitderivat zu einem SSL mittels des Sulfitderivats, und drittens bewirkt die Entfernung der Sulfonatgruppe durch alkalische Behandlung einen SSL-Rest.

Anschließend wird der Zielbereich mittels primerspezifischer Bisulfitumwandlung und PCR-Amplifikation amplifiziert. Der letzte Schritt besteht im Klonen und Sequenzieren des PCR-Produkts, um eine Einzelnukleotid-Auflösung der Methylierung entlang des DNA-Moleküls zu erhalten. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die DNA-Methylierung von CpG-Dinukleotiden in genomischer DNA auf, indem die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin gegenüber 5-Methylcytosin gegenüber Bisulfit-Desaminierung unter sauren Bedingungen ausgenutzt wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Southern-Blot-Analyse besteht darin, dass sie eine Einzelnukleotid-Auflösung der DNA-Methylierung ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, beispielsweise welche Rolle die DNA-Methylierung bei menschlichen Erkrankungen wie Krebs spielt. Um DNA-Proben für die Bisulfitumwandlung vorzubereiten, inkubieren Sie zunächst zwei Mikrogramm genomische DNA mit Bisulfit, DNA-Lysepuffer und einem Gesamtvolumen von 18 Mikrolitern eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Anschließend denaturieren Sie die genomische DNA, indem Sie zwei Mikroliter frisch zubereitete dreimolare Natronlauge hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,3 molaren zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad, gefolgt von einer Inkubation bei 90 Grad Celsius für zwei Minuten. Stellen Sie die Röhrchen danach unmittelbar in einem Heizblock für fünf Minuten auf Eis, zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Sekunden bei 10.000 ×g, um sicherzustellen, dass sich die DNA am Boden des Röhrchens befindet. Die denaturierten DNA-Proben sind nun bereit für die B-Zell-Fight-Deaminierung, die im nächsten Schritt demonstriert wird.

Vor den Sulfatierungs- und hydrolytischen Deaminierungsreaktionen bereiten Sie frische Lösungen von 10 Millimolar Chinol und gesättigtem Natriummetabissulfit bei pH 5,0 zu. Da es sich beim Natriummetabissulfit um eine gesättigte Lösung handelt, können kleine Klumpen ungelöst verbleiben. Geben Sie 208 Mikroliter Natriummetabissulfit und 12 Mikroliter Chinol zu 20 Mikrolitern denaturierter DNA in einem Endvolumen von 240 Mikrolitern hinzu.

Vortexen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie für 10 Sekunden, um sicherzustellen, dass alle Tropfen am Boden des Röhrchens liegen. Überdecken Sie die Proben mit Mineralsöl. Inkubieren Sie die Proben je nach Menge und Qualität der zu konvertierenden DNA vier bis 16 Stunden lang bei 55 Grad Celsius in einem Wasserbad.

Es ist wichtig, dass die Bisulfitumwandlung im Dunkeln erfolgt, um eine Oxidation zu vermeiden. Am Ende der geeigneten Inkubationszeit die Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet. Anschließend die DNA-Lösung vorsichtig vom Boden des Röhrchens abpipettieren, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein Mineralsöl mitaufgenommen wird.

Für die nächsten Schritte verwendet unser Labor das Promega Wizard DNA-Reinigungssystem. Geben Sie ein Milliliter Harz zu den DNA-Proben hinzu, drehen Sie das Gefäß um, um es zu mischen, und pipettieren Sie die Lösung anschließend in eine Spritze, die mit einer Desalting-Säule verbunden ist. Schließlich wird die DNA, die mit Bisulfit behandelt wurde, durch die Desalting-Säule geleitet, um freie Bisulfit-Ionen zu entfernen, und mit 50 Mikrolitern Milli-Q-Wasser eluiert.

Der nächste Schritt besteht darin, das Bisulfit-Addukt vom Uracilring durch Desaminierung zu entfernen. Fügen Sie hierzu 5,5 µL frisch zubereiteter dreimolarer Natriumhydroxidlösung zu jeder bisulfitbehandelten DNA-Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 mol/L zu erreichen. Anschließend werden die Proben 15 Minuten bei 37 °C inkubiert.

Zentrifugieren Sie die Proben kurz und geben Sie dann ein Mikroliter tRNA zu jeder Probe hinzu. Puffern Sie die Lösung durch Zugabe von Ammoniumacetat auf eine Endkonzentration von drei Molaren. Führen Sie anschließend eine Ethanolpräzipitation der DNA durch.

Fügen Sie 330 Mikroliter eiskalte, 100 %igen Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen gut durch. Lassen Sie die Probe eine Stunde bis über Nacht bei minus 20 Grad Celsius stehen, dann bei 14.000 ×g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie anschließend sämtliche Reste des Überstandes und lassen Sie die präzipitierte DNA für etwa 20 Minuten an der Luft trocknen.

Nach dem Lufttrocknen ist das Pellet kaum sichtbar. Resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XTE oder Wasser und lassen Sie es etwa zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen. Vortexen Sie die Röhrchen dabei gelegentlich, um sicherzustellen, dass die DNA vollständig gelöst wird, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation. Sobald die DNA gelöst ist, kann sie je nach Menge und Qualität ein bis zehn Jahre bei minus 20 Grad Celsius gelagert oder sofort verwendet werden. Bei der PCR-Amplifikation ist die Primer-Optimierung der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.

Daher werden die folgenden Richtlinien bereitgestellt, um eine erfolgreiche Primer-Designsicherheit zu gewährleisten. Um diese Richtlinien zu veranschaulichen, wurde die Zielsequenz durch Sulfit konvertiert, sodass konvertierte Cytosine beim Schreiben als blaue Ts erscheinen und nicht konvertierte CpG-Stellen als rote Cgs. Primer sollten 24 bis 30 Basenpaare lang sein, um Spezifität sicherzustellen. Primer sollten eine ähnlich vorhergesagte Tm über 50 Grad Celsius aufweisen und sich um nicht mehr als ein bis zwei Grad Celsius unterscheiden.

Primer sollten mehrere Basen mit etwa 25 % C zu T enthalten, um die Konversionsspezifität sicherzustellen. Die letzte Base am 3'-Ende sollte eine C-zu-T-Basis sein, um die Amplifikation konvertierter DNA-CpG-Dinukleotide zu gewährleisten. CpG-Dinukleotide sollten in der Primersequenz vermieden werden, um eine potenzielle Verzerrung zugunsten methylierter, unmethylierter oder nicht konvertierter Vorlagen zu vermeiden. Falls dies jedoch nicht vermeidbar ist, sollte das Cytosin an der CpG-Stelle durch ein Y ersetzt werden, um eine unverzerrte Amplifikation der konvertierten DNA sicherzustellen.

Entwerfen Sie abschließend geschachtelte oder halbgeschachtelte Primer-Sets, um gegebenenfalls die Spezifität oder Empfindlichkeit der PCR-Reaktion sicherzustellen. Bereiten Sie die PCR-Amplifikationsansätze in 25-Mikroliter-Aliquoten zur Optimierung vor. Jeder Ansatz enthält sulfitzierungsbehandelte genomische DNA, DPS-Primer, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Tris-Hydrochlorid (pH 8,3) und eine DNA-Polymerase, um eine Amplifikationsverzerrung für methyliertes oder unmethyliertes Material zu überprüfen.

Verwenden Sie eine 50:50-methylierte, nicht-methylierte, vollständig bisulfitkonvertierte Kontrollprobe, um die proportionale PCR-Amplifikation nach Bisulfitumwandlung zu testen. Verwenden Sie spezifische Primer und PCR-Reaktionsmix in einem Thermocycler mit Temperaturgradienten, und stellen Sie die Reaktionsbedingungen in einem Gradienten von plus/minus drei Grad Celsius bezüglich der Schmelztemperatur (TM) des Primers über acht bis zehn Reaktionsgefäße ein. Vortexen Sie die Röhrchen und zentrifugieren Sie sie kurz in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie sie in den Thermocycler geben. Diese Abbildung zeigt ein Agarosegel mit einem Temperaturgradienten-PCR-Amplifikationsprofil aus einer Mischung aus 50 % methylierter und nicht-methylierter DNA.

Die PCR-Amplicons und die mit T markierten Gelele, nämlich die Gelele zwei, fünf und acht, wurden mit einem Restriktionsenzym behandelt, das ausschließlich methylierte DNA spaltet. Optimale PCR-Amplifikationsbedingungen sollten methylierte und unmethylierte Amplicons proportional und unverzerrt amplifizieren, was zu einer gleichen Menge an geschnittenen und ungeschnittenen PCR-Produkten führt, wie hier zu sehen ist. Die optimalen Thermocycling-Bedingungen für eine unverzerrte Amplifikation liegen bei 55,6 Grad Celsius. Die vollständige Konversion der Bisulfit-DNA kann durch Verdau mit einem cytosinspezifischen Enzym analysiert werden, das ausschließlich nicht konvertierte DNA spaltet, wie in den Gelelen drei, sechs und neun zu sehen ist.

Eine vollständige Bisulfit-DNA-Umwandlung wird hier durch das Fehlen von geschnittener DNA in allen drei Gelen, den Gelen drei, sechs und neun, angezeigt. Diese Echtzeit-Dissociationskurve zeigt ein gleichmäßiges Verhältnis von methylierter und unmethylierter DNA – rostrote Linie, 50:50-Mischung – im Vergleich zur Kontrollvermehrung vollständig methylierter DNA – rosa Linie, m – und unmethylierter DNA – grüne Linie, U –, die bei jeweils 82,9 °C und 86,9 °C dissoziieren. Dies zeigt, dass keine Amplifikationsverzerrung aufgrund der Temperatur vorliegt, bei der die unterschiedlichen Moleküle dissoziieren.

Die resultierenden PCR-Fragmente aus der Amplifikation von Bisulfit-behandelten Proben können mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht und sequenziert werden. Direkt dargestellt ist hier eine Sequenzablaufkurve aus drei verschiedenen Zelllinien, wobei die CPG-Stellen gelb hervorgehoben sind; die Zelllinie X weist an allen drei CPG-Stellen eine 100 %ige Methylierung auf, während die Zelllinien Y und Z unterschiedliche Grade der Methylierung zeigen, wie durch überlappende GA-Signale ersichtlich. Abbildung vier A ist eine Sequenzablaufkurve aus drei verschiedenen Zelllinien, wobei die CPG-Stellen gelb hervorgehoben sind.

Nach der direkten Sequenzierung einzelner Klone können die Methylierungszustände der einzelnen Moleküle in einer Bisulfit-Karte erfasst werden. Um die heterogene Methylierung zu veranschaulichen, ist die Dichte der Methylierung an einzelnen CpG-Stellen in Rot dargestellt. In dieser repräsentativen Bisulfit-Karte erfolgt die hochdurchsatzfähige quantitative Methylierungsanalyse einer Probe.

Mithilfe der Sequenome-Epi-Typer-Technologie kann ein spezifisches Spektrum erzeugt werden, das von der Anwesenheit methylierter Cytosine abhängt, wie in diesem Beispiel Abbildung fünf A dargestellt. Eine Zusammenfassung der Verhältnisse in der Probe kann anschließend in Form einer Epigramm-Abbildung fünf B extrapoliert werden. Dieses Beispiel zeigt den Prozentsatz der DNA-Methylierung an jeder CPG-Stelle für vier verschiedene Zelllinien. Schließlich kann ein Zusammenfassungsdiagramm der Methylierung, Abbildung fünf C, aus dem Epigramm nach dessen Erstellung abgeleitet werden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Epigenetik, um die DNA-Methylierung und ihre Rolle bei menschlichen Erkrankungen zu erforschen.