Strukturierung von embryonalen Stammzellen mit dem Bio Flip Chip
1. Oktober 2007
Wir zeigen eine einfache Methode für die Platzierung Zellen an gewünschten Stellen auf einem Substrat. Diese Methode Mustern Zellen, indem ein Silikon-Chip mit Vertiefungen, die mit Zellen auf dem Substrat gefüllt. Diese Methode bietet eine neue Art und Weise zu modulieren diffusionsfähig und juxtacrine Signalisierung zwischen den Zellen.
Ich bin Nickel Mital. Ich bin Doktorandin im Labor von Bowman. Heute werde ich über eine von zwei ehemaligen Studierenden in unserem Labor entwickelte Vorrichtung sprechen, die als Bio-Flip-Chip bezeichnet wird.
Und dieses Gerät ermöglicht die Applikation von Zellen auf einem Substrat nach Wahl des Experimentators in einer Konfiguration nach dessen Wahl. Das Gerät selbst, von dem wir hier eines vorliegen haben, ist sehr einfach aufgebaut. Es besteht im Wesentlichen aus winzigen Vertiefungen in einem Stück Silikon.
Jede Vertiefung ist normalerweise so ausgelegt, dass sie nur eine einzelne Zelle aufnehmen kann, aber falls erforderlich, können wir sie natürlich auch größer gestalten. Die Herstellung des Geräts erfolgt so, dass die Anordnung der Vertiefungen der späteren Position der Zellen auf dem Substrat entspricht. Das Gerät selbst wird daher mittels weicher Lithografie hergestellt.
Insbesondere verwenden wir PDMS, also Polydimethylsiloxan, und formen dies anhand eines Siliziumwafers ab. Einen solchen haben wir hier. Der Form-Wafer selbst wird mittels Standard-Photolithographie hergestellt, um einen SUA-Photoresist, der auf den Siliziumwafer aufgeschleudert wurde, zu strukturieren.
Also im Wesentlichen werden die Zellen auf das gewünschte Substrat übertragen, indem man die Vertiefungen des Bio-Flip-Chips einfach mit diesen Zellen auffüllt. Anschließend bringen wir den Chip auf das gewünschte Substrat auf, häufig ein Polystyrol-Gewebezüchtungssubstrat. Schließlich drehen wir die Kombination um, wodurch die Zellen aus den Vertiefungen herausfallen und auf das Substrat gelangen.
Ich bin Stephanie Flavin. Ich bin eine studentische Mitarbeiterin im Goldman-Labor, und heute werde ich demonstrieren, wie man den Bio-Flip-Chip verwendet, um Zellen am Tag zuvor zu mustern. Wir möchten ein Musterversuch durchführen.
Wir werden das PDMS an eine ein Zoll mal ein Zoll große Glasobjektträgerplatte plasmabindend befestigen. Anschließend lassen wir den Chip über Nacht, mit der Mulde nach unten, in einer PBS-Lösung einweichen. Außerdem schneiden wir Dichtungen für das Musterversuch zurecht und sammeln Büroklammern, die ebenfalls verwendet werden sollen.
Tragen Sie 200 Mikroliter BSA auf die Oberfläche jedes Chips auf. Schütteln Sie die Oberfläche des Chips leicht mit der Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen, und lassen Sie die BSA-Lösung die Vertiefungen vollständig ausfüllen. Lassen Sie die Chips eine Stunde lang unter der Haube bei UV-Lichtbehandlung wie üblich in den Durchgangszellen stehen.
Nach einer Stunde die BSA-Lösung von den Chips abpipettieren und jeden Chip mit 200 µl PBS spülen. Anschließend 200 µl Passagenzelllösung mit einer Dichte von 10⁶ Zellen pro ml aufbringen. Nachdem man 5 bis 10 Minuten gewartet hat, bis die Zellen in die Vertiefungen gesunken sind, wird die Oberfläche des Chips mit PBS gespült. Den Chip in eine Ecke unter einem Winkel von etwa 15 Grad kippen und die Zelllösung langsam von der unteren Ecke des Chips abpipettieren.
Bringen Sie den Chip wieder in horizontale Lage und geben Sie langsam 50 µL PBS in die obere Ecke. Wiederholen Sie den Waschschritt so oft wie nötig. Sobald die xls von der Oberfläche des Chips entfernt wurden, geben Sie etwa 50 µL Medium in die innere Dichtung der Schale.
Geben Sie Medium auf die Oberseite jedes Chips. Drehen Sie danach die Schale um und kippen und senken Sie sie auf die Oberfläche des Chips, beginnend an einer Ecke. Dann drücken Sie die Schale vollständig auf den Chip, um die Bildung von Blasen zwischen Schale und Chip zu vermeiden.
Befestigen Sie Büroklammern an jeder Seite des Chips, um ihn zu sichern. Entfernen Sie die Griffe von jeder Büroklammer, sodass der Chip nach dem Umkippen eben auf der Schale aufliegt. Bringen Sie den Chip in den Inkubator und kippen Sie ihn schnell um, wobei jegliche unnötige Bewegung vermieden wird.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Methode zur Positionierung von Zellen auf einem Substrat mithilfe eines Geräts namens Bio-Flip-Chip vor. Durch das Umkehren eines Silikonchips mit Mikrotöpfchen, die mit Zellen gefüllt sind, auf das Substrat können Forscher die Zellplatzierung gezielt steuern und dadurch die Modulation der Signalübertragung zwischen Zellen verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Bioingenieurwesen
Hintergrund
- Die Zellpositionierung ist entscheidend für die Untersuchung zellulärer Interaktionen.
- Aktuelle Methoden weisen möglicherweise eine ungenaue Zellplatzierung auf.
- Der Bio-Flip-Chip bietet eine einfache und effektive Lösung.
- Diese Technik kann sowohl diffusible als auch juxtakrine Signalwege beeinflussen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Platzierung von Zellen auf Substraten.
- Verbesserung des Verständnisses der Mechanismen der Zellsignalgebung.
- Bereitstellung eines Werkzeugs für Forscher in verschiedenen biologischen Fachgebieten.
Verwendete Methoden
- Konstruktion und Herstellung des bio-flip-chip.
- Befüllen der Mikrotöpfe mit Zellen.
- Umkehren des Chips auf das gewünschte Substrat.
- Beobachtung und Analyse der Zellpositionierung und Signalgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Platzierung von Zellen an gezielten Positionen.
- Verbesserte Modulation der Zellsignalgebung.
- Veranschaulichung der einfachen Handhabung des Geräts.
- Mögliche Anwendungen in verschiedenen experimentellen Aufbauten.
Schlussfolgerungen
- Der Bio-Flip-Chip ist ein innovatives Werkzeug für die Zellplatzierung.
- Diese Methode kann die Untersuchung zellulärer Signalwege erheblich beeinflussen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können diese Technik für weiterreichende Anwendungen erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die präzise räumliche Kontrolle von Zellpopulationen ermöglicht die mechanistische Untersuchung diffusibler und juxtakriner Signalwege, die für die Zielstrukturvalidierung in zellbasierten Krankheitsmodellen von entscheidender Bedeutung sind. Der Bio Flip Chip bietet ein substratunabhängiges, chemieerhaltendes Verfahren, um definierte zelluläre Mikroumgebungen zu strukturieren und die reproduzierbare Assay-Entwicklung für phänotypische Screening-Verfahren zu unterstützen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die Variabilität bei Zell-Zell-Kontakten und der Exposition gegenüber parakrinen Faktoren verringert und somit die translationale Kontinuität von In-vitro-Modellen zur präklinischen Validierung verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Hypothesenprüfung darüber, wie die lokale Zelldichte und räumliche Anordnung die Differenzierung und Selbsterneuerung von Stammzellen beeinflussen.
- Operativer Wert: Beseitigt stochastische Variabilität durch zufälliges Aussäen und gewährleistet somit konsistente juxtakrine und parakrine Signalübertragungen über alle Wiederholungen hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem der Beitrag kontaktabhängiger gegenüber löslicher Signalwege bei Target-Bindungsstudien isoliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare, räumlich definierte Zellanordnungen, die mit bildbasierten Hochdurchsatzanalysen und multiplexen Nachweismethoden kompatibel sind.
- Operationeller Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Zell-Zell-Interaktionsassays auf verschiedenen Substraten wie Gewebekultur-Polystyrol, Glas, Matrigel und Futterzellagen, ohne die Chemie des Substrats zu verändern.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Mikrokontaktdruckverfahren zur Erzeugung von Mustern der extrazellulären Matrix, wodurch eine kombinatorische Steuerung von Adhäsions- und Signalreizen möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Mustert embryonale Stammzellen in definierten Nischen, um entwicklungsbiochemische Signalwege zu modellieren, die für angeborene Erkrankungen und die regenerative Medizin relevant sind.
- Präklinisches Modellieren: Ermöglicht die Dosis-Wirkungs-Analyse von Morphogenen oder Therapeutika in räumlich kontrollierten Mikroumgebungen und verbessert dadurch die physiologische Relevanz.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Verringert falsch positive Ergebnisse bei der Leitsubstanzidentifizierung, indem Störungen durch unkontrollierte Zellaggregation oder variable Kontaktfrequenzen minimiert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Bio-Flip-Chip lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem er eine reproduzierbare Musterung von Stammzellen vor der Exposition gegenüber Verbindungen ermöglicht und so hypothesengetriebene Screening-Verfahren sowie mechanistische Nachuntersuchungen in der Optimierung von Wirkstoffkandidaten unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Untersucht, wie eine definierte räumliche Organisation embryonaler Stammzellen die Linienspezifizierung und Signalwegaktivität beeinflusst.
- Screening: Stellt standardisierte, reproduzierbare zelluläre Substrate bereit, um die Wirkung von Substanzen auf kontaktabhängige und diffusible Signalübertragung zu bewerten.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative räumliche Kartierung der Markerexpression, Proliferation und Apoptose als abhängige Variablen in strukturierten Kokulturen.
- Translationale Forschung: Modelliert menschliche Entwicklungssignalwege in räumlich kontrollierten Systemen, um die präklinische Zielstrukturauswahl zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulare Strukturierungsplattform, die an verschiedene Zelltypen, Substrate und Konfigurationen der extrazellulären Matrix über Projekte hinweg anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem biologisches Rauschen durch unkontrollierte Zell-Zell-Interaktionen reduziert wird.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit von Assays sicher durch präzise, benutzerdefinierte Zellplatzierung, unabhängig von der Variabilität der Ansiedlungstechnik.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem das Signal-Rausch-Verhältnis in phänotypischen Bildschirmen, die auf die interzelluläre Kommunikation abzielen, erhöht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Modulatoren juxtakriner Signalwege (z. B. Notch, Wnt) in Bereichen von Krankheiten, die durch Stammzellen vermittelt werden.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in der Weichlithografie und im Umgang mit PDMS für die Herstellung oder Beschaffung von Chips.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Plasma-Bonding-Ausrüstung und UV/Ozon-Behandlung für die Substratvorbereitung ab.
- Erfordert standardisierte Protokolle zur Zellvorbereitung und -wäsche, um eine effiziente Beladung und Freisetzung der Vertiefungen sicherzustellen.
- Die Anpassung an 3D-Matrizen oder mikrofluidische Systeme kann eine Optimierung des Umkehrzeitpunkts und der Oberflächenenergie erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Belegung der Vertiefungen muss für jeden Zelltyp und jede Zellgröße empirisch bestimmt werden, um Mehrfachzellbeladung in für Einzelzellen konzipierten Vertiefungen zu vermeiden.
