Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen
12. Januar 2012
Eine einfache und bequeme Methode, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen zu bestimmen, ist beschrieben. Diese Technik ermöglicht es, die Funktion der elektrischen Synapsen zwischen Nervenzellen im intakten Netzhaut unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Cut-Loading-Experiments ist es, das Ausmaß der Gap-Junction-Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in der intakten Netzhaut unter kontrollierten Beleuchtungsbedingungen zu untersuchen. Der erste Schritt wird erreicht, indem Netzhäute mit einer scharfen Klinge geschnitten werden, die in eine Lösung von Neurobiotin getaucht ist, einem Tracermolekül, das durch offene Gap-Junction-Kanäle, aber nicht durch Zellmembranen diffundieren kann. Im zweiten Schritt werden die Netzhäute in Ringerlösung inkubiert, was eine Tracerdiffusion durch offene Gap-Junction-Kanäle ermöglicht.
Wenn die Gap-Junction-Kopplung schwach ist, ist die Neurobiotin-Fluoreszenz auf retinale Neuronen beschränkt, die sich in der Nähe des Schnitts befinden. Im Gegensatz dazu wird die Fluoreszenz bei starker Gap-Junction-Kopplung in retinalen Neuronen nachgewiesen, die weit vom Schnitt entfernt sind. Der Hauptvorteil der Cut-Loading gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass es einfacher ist, sie an Neuronen mit kleinen Zellkörpern in intaktem neuronalem Netzhautgewebe durchzuführen.
Es ist auch einfacher, die Beleuchtungsbedingungen während der Schnittbelastung zu kontrollieren als bei einer elektrophysiologischen Untersuchung einzelner Neuronen in intaktem Netzhautgewebe. Da die Lichtreize, die während der elektrischen Aufzeichnung verwendet werden, selbst zu Veränderungen in der Gap-Junction-Kopplung führen können, wird Dr. Chu Choi, ein Postdoc aus meinem Labor, die Technik demonstrieren. Bei diesem Verfahren wird ein Goldfisch vor der Operation tagsüber mindestens eine Stunde lang in ständiger Dunkelheit gehalten, und alle folgenden Schritte bis zur Fixierung des Netzhautgewebes werden ebenfalls tagsüber in ständiger Dunkelheit durchgeführt, der Goldfisch wird durch Zugabe von 150 Milligramm Methansulfonat pro Liter zum Aquarienwasser tief betäubt.
Opfern Sie dann den Goldfisch nach den Richtlinien des Bundes und der Universität und entfernen Sie vorsichtig seine Augäpfel. Entfernen Sie als Nächstes den vorderen Teil jedes Augapfels. Legen Sie dann ein Stück Filterpapier auf den hinteren Teil des Auges und drehen Sie das Filterpapier und das Auge um, so dass sich das Filterpapier unter dem hinteren Teil des Auges befindet.
Entfernen Sie nun vorsichtig den Augenhintergrund, einschließlich der Sklera und des Pigmentepithels des dunkel angepassten Goldfisches. Netzhaut: Schneiden Sie den Sehnerv mit einer feinen Schere durch. Der neurale Goldfisch sollte nun mit der Netzhaut-orientierten Photorezeptorseite nach oben vor der Enukleation an das Filterpapier gebunden werden, während der Fisch mit fünf Millilitern Anästhesie unterzogen wird, die mit einer karbonatbasierten Ringerlösung mit oder ohne Testmedikament angereichert sind, in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, nachdem die intakte neurale Netzhaut aus dem hinteren Teil des Auges diseziert wurde.
Übertragen Sie die Netzhäute bei ständiger Dunkelheit in die Vertiefungen. Verschließen Sie dann die Vertiefungen mit Paraform und lassen Sie das Gewebe 30 Minuten lang inkubieren. Bereiten Sie 100 Mikroliter Tracerlösung vor, indem Sie 0,5 % Neurobiotin in Ringerlösung unmittelbar vor dem Durchschneiden der Netzhaut auflösen.
Geben Sie als Nächstes die Neuro-Biotin-Lösung in eine Petrischale aus Glas. Klopfen Sie dann vorsichtig auf ein Papiertuch auf das Filterpapier, an dem die Netzhaut befestigt ist. Um überschüssige Ringer zu entfernen, tauchen Sie eine Rasierklinge in die Neurobiotinlösung und machen Sie einen senkrechten radialen Schnitt durch die Netzhaut und das Filterpapier.
Tauchen Sie danach die Rasierklinge erneut in die Neuro-Biotin-Lösung und schneiden Sie die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie dies bis zu vier Schnitte pro Netzhaut. Übertragen Sie bei diesem Schritt die Netzhaut 15 Minuten lang auf frische Ringer, Medium mit oder ohne Testmedikament, um das Laden und Diffusion zu ermöglichen.
Waschen Sie es dreimal mit frischen Ringern, Medium mit oder ohne Testmedikament für jeweils fünf Minuten. Fixieren Sie dann die Netzhaut eine Stunde lang mit 4%para-Formaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpufferlösung bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Netzhaut über Nacht bei vier Grad Celsius mit 0,1 molaren PBS, indem Sie sie am nächsten Tag in den Kühlschrank stellen.
Reagieren Sie die Netzhaut mit 2 % Streptavidin Alexa 4 88 in 0,1 molaren PBS und 0,3 % Triton X 100 auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag. Waschen Sie die Netzhaut dreimal mit 0,1 molaren PBS bei Raumtemperatur jeweils 10 Minuten lang.
Trennen Sie die Netzhaut vom Filterpapier in PBS. Montieren Sie dann mit einem feinen Pinsel die Seite des Retina-Photorezeptors nach oben auf einen Objektträger mit Vector Shield Mount Medium. Übertragen Sie den Objektträger auf ein konfokales Laserscanning-Mikroskop und nehmen Sie für jede Versuchsbedingung Bilder mit der gleichen Vergrößerungsauflösung und den gleichen Einstellungen auf, so dass Vergleiche der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen auf das Ausmaß der lückenfunktionellen Tracerkopplung gezeigt werden können.
Hier ist das Ausmaß der Photorezeptorzell-Tracer-Kopplung während des Tages in ständiger Dunkelheit im Vergleich zu tagsüber in ständiger Dunkelheit in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D-Zwei-Rezeptor-Antagonisten. Beachten Sie, dass sich der Rasiermesserschnitt auf beiden Bildern auf der linken Seite befindet. Obwohl ein einzelnes Bild alle beschrifteten Zellen enthalten kann, wird empfohlen, einen Z-Stapel des interessierenden Bereichs zu erfassen und ihn in einem einzigen angezeigten Bild zu reduzieren.
Hier ist das Ausmaß der Tracer-Kopplung von Photorezeptorzellen, wenn man sich sequentiell durch einen solchen Zack bewegt. Beachten Sie, dass sich der Rasiermesserschnitt in diesem Bild auf der rechten Seite befindet. Um das Ausmaß der Tracer-Kopplung im LSM-Bildbrowser zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild, klicken Sie dann auf Exportieren und speichern Sie das Bild als TIF-16-Bit-Dateimaßstabsbalken, der in diesem TIFF-Bild mit der NIH Image J-Software enthalten sein sollte.
Messen Sie die Fluoreszenzintensität von Alexa 4 88-markiertem Neurobiotin aus Bildern mit geringer Vergrößerung von Loch-Mount-Netzhäuten. Öffnen Sie die TIFF-Datei mit der Image J-Software und zeichnen Sie dann eine gerade Linie, die der Maßstabsleiste entspricht. Gehen Sie als Nächstes zu Analyse, stellen Sie den Maßstab ein und geben Sie die bekannte Entfernung und die Längeneinheit ein.
Klicken Sie dann auf OK. Nun können die Fluoreszenzmessungen in kalibrierten Einheiten wie Millimetern dargestellt werden. Wählen Sie anschließend den Interessenbereich mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug aus.
Die Spitze der Fluoreszenz sollte am linken Rand Ihrer Auswahl positioniert sein. Stellen Sie sicher, dass sich in der Nähe des rechten Randes kein Fluoreszenzsignal befindet. Klicken Sie auf Analysieren und Diagramm für die Tagessteuerungsdaten, die bei ständiger Dunkelheit erhalten wurden.
Eine Kurve mit exponentiellem Abfall wird von links nach rechts dargestellt. Klicken Sie dann im Popup-Fenster auf Kopieren und fügen Sie es in Excel ein. Nun gibt es zwei Spalten, von denen eine den Abstand vom Schnitt und die andere die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom Abstand vom Schnitt anzeigt.
Zum Vergleich werden die obigen Schritte mit Daten wiederholt, die bei ständiger Dunkelheit am Tag gewonnen wurden. In Gegenwart von Spit Bro dividieren Sie jeden Rohfluoreszenzwert durch den maximalen Fluoreszenzwert, um die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. Kopieren Sie zwei Spalten, die dem Abstand vom Schnitt und der relativen Fluoreszenzintensität entsprechen, und fügen Sie sie dann in die Ursprungssoftware ein.
Diese Schritte werden sowohl für die Tagessteuerung als auch für die Tagesspucke angezeigt. Die Laufdaten an diesem Punkt passen die Ergebnisse an den exponentiellen Abfall an. Funktion Nummer eins: Vergleichen Sie die Werte der Raumkonstante unter verschiedenen experimentellen Bedingungen mit einem T-Test oder Inova.
Zum Vergleich werden Exponentialfunktionen und statistische Analysen von Tagessteuerungs-, Tages- und Nachtsteuerungsdaten gezeigt. Gezeigt. Hier sind Beispiele für das Ausmaß der Photorezeptorzell-Tracer-Kopplung in der dunkel angepassten Goldfisch-Netzhaut am Tag A, in der Nacht B und am Tag in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D-Zwei-Rezeptor-Antagonisten, wie durch die Cut-Loading-Technik gezeigt. Alle konfokalen Bilder wurden mit den gleichen Einstellungen zum Vergleich aufgenommen.
In diesem Diagramm wird die Fluoreszenzintensität für drei experimentelle Bedingungen als Funktion des Abstands vom Schnitt aufgetragen und durch die Exponentialfunktion angepasst. Die Schnittbelastungstechnik wird verwendet, um das Ausmaß der Gap-Junctional-Tracer-Kopplung durch Berechnung von Raumkonstantenwerten zu quantifizieren, wie hier für drei experimentelle Bedingungen gezeigt. Die Cut-Loading-Technik kann auch verwendet werden, um die elektrischen Synapsen zwischen anderen Zelltypen in der Netzhaut und bei anderen Spezies zu untersuchen.
Diese beiden Abbildungen zeigen beispielsweise, dass horizontale Kaninchenzellen vom A-Typ und vom B-Typ unter dunkeladaptierten Bedingungen eine homologe Tracer-Kopplung, Cut-Loading und Diffusion von Neuro-Biotin aufweisen. Wir haben die Schnittbelastungstechnik verwendet, um das Ausmaß der Tracerdiffusion durch die Gap Junctions zwischen Stäben und Zapfen bei Tag und Nacht zu untersuchen. Darüber hinaus kann mit dieser Technik bestimmt werden, ob die Tracer-Kopplung zwischen anderen retinalen Neuronen durch die Netzhautuhr oder durch bestimmte Hell-Dunkel-Bedingungen gesteuert wird.
Es kann auch verwendet werden, um die Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in anderen Gehirnregionen zu untersuchen.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Gap-Junction-Tracer-Kopplung zwischen retinalen Neuronen. Die Technik ermöglicht die Untersuchung elektrischer Synapsen in der intakten Netzhaut unter verschiedenen Beleuchtungsbedingungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsgebiet
- Neurowissenschaften
- Retinale Biologie
- Zelluläre Kommunikation
Hintergrund
- Gap Junctions ermöglichen die Kommunikation zwischen Neuronen.
- Das Verständnis der Tracer-Kopplung kann Einblicke in die neuronale Funktion geben.
- Bestehende Methoden können für kleine Zellkörper in intaktem Gewebe herausfordernd sein.
- Beleuchtungsbedingungen können die Gap-Junction-Kopplung beeinflussen.
Zweck der Studie
- Eine bequeme Methode zur Beurteilung der Gap-Junction-Kopplung zu entwickeln.
- Die Auswirkungen der Beleuchtung auf elektrische Synapsen in retinalen Neuronen zu untersuchen.
- Bestehende Techniken zur Untersuchung kleiner neuronaler Strukturen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Netzhäute werden geschnitten und mit Neuro-Biotin-Tracer beladen.
- Inkubation in Ringer-Lösung ermöglicht die Tracer-Diffusion.
- Fluoreszenz wird analysiert, um die Kopplungsstärke zu beurteilen.
- Experimentelle Bedingungen werden kontrolliert, um externe Einflüsse zu minimieren.
Hauptergebnisse
- Die Fluoreszenzintensität zeigt das Ausmaß der Tracer-Kopplung an.
- Die Ergebnisse variieren je nach Beleuchtungsbedingungen und Tageszeit.
- Die Schnittbeladung erweist sich als effektiv für kleine neuronale Strukturen.
- Vergleichende Analyse über verschiedene experimentelle Setups wird erleichtert.
Schlussfolgerungen
- Die Schnittbeladungsmethode ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung retinaler Neuronen.
- Beleuchtungsbedingungen beeinflussen die Gap-Junction-Kopplung erheblich.
- Diese Technik kann unser Verständnis der neuronalen Kommunikation verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Assessing gap junction-mediated communication in retinal neurons supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling mechanistic de-risking of synaptic modulators. The cut-loading technique provides quantitative, spatially resolved tracer diffusion data under controlled illumination, improving predictive confidence in early-stage target engagement studies. This approach addresses a key technical barrier in studying small neuronal structures in intact tissue, facilitating reproducible assay development for pathway clarification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying gap junction tracer coupling as a functional readout of electrical synaptic strength.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized tracer diffusion measurements that clarify target modulation by neurotransmitters or drugs.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative space constant values that reflect coupling efficacy across experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (intact retinas) with gap junction permeability suitable for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized tracer loading and diffusion protocols under constant darkness, reducing variability from light-induced conductance changes.
- Quantitative Output: Produces fluorescence intensity profiles that can be normalized and fitted to exponential decay models for inter-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports investigation of retinal circadian regulation of gap junctions, a mechanism relevant to visual processing disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical continuity by enabling consistent assessment of tracer coupling across light/dark conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on modulator effects (e.g., D2 receptor antagonists) to inform go/no-go progression based on target engagement evidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of gap junction modulators prior to lead identification, with outputs directly informing target confidence and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the effect of illumination and pharmacological agents on tracer diffusion through gap junctions.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable tracer diffusion, supporting reliable evaluation of compound effects on neuronal coupling.
- Analytics: Generates calibrated fluorescence intensity and space constant measurements that allow statistical comparison (e.g., T-test) of coupling strength across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling assessment of tracer coupling regulation by retinal clock and light/dark cycles, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying gap junction coupling across retinal neuron types and species, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in electrical synaptic communication.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled illumination and standardized tracer loading procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on quantitative target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing empirical data on modulator effects across temporal and pharmacological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, tracer handling, and fluorescence microscopy under controlled darkness.
- Dependent on instrumentation for microcutting, incubation, confocal imaging, and fluorescence quantification (e.g., ImageJ, Origin).
- Necessitates cross-team standardization of illumination protocols, tracer concentration, and cut depth to ensure reproducible coupling measurements.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other neuronal systems or species with varying tissue thickness and gap junction permeability.
- Practical limitations include the need for permeable tracers like neuro biotin and the inability to assess non-tracer-coupled electrical synapses directly.
