Name: Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Cut-Loading-Methode zur Untersuchung der Gap-Junction-Kopplung zwischen Netzhautneuronen. Diese Technik ermöglicht die Analyse elektrischer Synapsen unter kontrollierten Lichtbedingungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vom NIH EY005102 zu SCM und EY018640 zu CPR finanziert

1. Intact neuronalen Retina-Präparaten für Goldfische, Mäuse und Kaninchen <ol><li> Führen Sie alle folgenden Schritte, einschließlich derer im Abschnitt "2) Cut-loading", bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung. Bitte beachten Sie, dass für die Zwecke dieses Protokolls, die Verfahren beschrieben werden, wie ausgeführt in konstanter Dunkelheit (dh unter sehr dunklen (dh "skotopischen") Bedingungen ≤ 0,0001 lux) mit Nachtsicht Infrarot-Brille, sondern auch andere höhere Intensitäten der konstanten Umgebungsbeleuchtung können stattdessen verwendet werden, um die Wirkung von anderen Ebenen der Umgebungsbeleuchtung auf Gap Junction-Tracer-Kopplung zu bestimmen. </li><li> Dark-Anpassung des Versuchstieres (Goldfische, Maus oder Kaninchen) für mindestens 1 Stunde vor der Operation. </li><li> Wie zuvor beschrieben 7, tief betäuben Goldfische, indem man sie in Tricaine Methansulfonat (MS222, 150 mg / l gepuffert (Natrium-Bicarbonat-haltigen) Aquarium Wasser), und tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg/ Kg, ip) und Rompun (10 mg / kg, ip). Tief betäuben Kaninchen mit Urethan (Loading dose: 2,0 g / kg, ip) und auch lokale intraorbitale Anästhesie (2% Xylocain), wie zuvor beschrieben 8. Alle Experimente, die die Pflege und Nutzung von Tieren im Einklang mit Bundes-Richtlinien durchgeführt und überprüft und von den örtlichen Universität Tier in Pflege und Gebrauch Ausschüsse genehmigt werden. (Hinweis:. In den Experimenten hier beschrieben, alle experimentellen Verfahren, die die Pflege und Nutzung der Fische, Mäuse und Kaninchen wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien durchgeführt und wurden überprüft und genehmigt von der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee) </li><li> Für Fische, Mäuse und Kaninchen, nach Enukleation, entfernen Sie den vorderen Teil eines jeden Augapfel. Legen Sie dann ein Stück Filterpapier auf der Oberseite des hinteren Teil des Auges und invertieren die Filterpapier und Auge, so dass das Filterpapier unter dem hinteren Teil des Auges ist. Dann, mit feinenPinzetten sezieren die intakte neuronale Retina aus dem hinteren Teil des Auges durch leichtes Abziehen der Pigmentepithel / Aderhaut / Lederhaut, die miteinander verbunden sind, aus der neuronalen Netzhaut, die das Filterpapier angebracht ist. Als dies geschehen ist, schneiden Sie den Sehnerv mit feinen federbelastete Schere. Die neuronalen Netzhaut, orientiert Photorezeptor-side up, sollte nun auf das Filterpapier befestigt werden und getrennt vom Rest des Auges. </li></ol> 2. Cut-loading <ol><li> Tauchen Sie die Netzhaut in Sauerstoff Ringer-Lösung (Tabelle 1) in einer 6-Well-Platte (~ 5 mL / well) für 30 min bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung (z. B. unter sehr dunklen (dh "skotopischen") Bedingungen) mit oder ohne ein Test Droge. Behalten Fisch Netzhaut in Sauerstoff (5% CO 2 / 95% O 2) Bicarbonat-basierten Ringer bei 22 ° C durch Abdichten der 6-Well-Platte mit Parafilm und pflegen Maus und Kaninchen Netzhaut bei 36 ° C in einer 5% igen CO 2 / 95% O <li> Bereiten Sie die Tracer-Lösung (typischerweise 100 ul) durch Auflösen neurobiotin (0,5%), einem biotinylierten Moleküls, in Ringer-Lösung unmittelbar vor Durchschneiden der Netzhaut. Beachten Sie, dass 0,5% Rhodamin Dextran (hoch (&gt; 10.000) MW) zu der Lösung hinzugefügt werden. Aufgrund seiner hohen Molekulargewicht, wird Rhodamin Dextran nicht überqueren Gap Junctions und nur Etiketten, Zellen, die durch den Schnitt beschädigt wurden. Wie in Abb.. 3, ist dies eine nützliche Methode, um Zellen, die angesammelten neurobiotin haben, weil sie verletzt wurden, von denen, die der Tracer angesammelt haben durch Diffusion durch gap junctions unterscheiden. </li><li> Legen Sie die neurobiotin Lösung auf ein Glas (oder Kunststoff) Petrischale, tippen Sie auf das Filterpapier, zu denen der Netzhaut angebracht ist, auf einem Papiertuch, um überschüssige Ringer entfernen, tauchen Sie ein Rasiermesser (oder andere scharfe Klinge) in der neurobiotin Lösung und dien einen radialen Schnitt durch die Netzhaut und Filterpapier. Falls gewünscht, können Abstandhalter verwendet werden, so dass der Schnitt durch die Retina wird, aber nicht das Filterpapier. Der Schnitt sollte senkrecht zu der Netzhaut. Tauchen Sie die Rasierklinge in der neurobiotin Lösung wieder und schneiden die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie diese bis zu 4 Schnitte pro Netzhaut (siehe Abb. 1).. Verwenden Sie ein Binokular Bei der Rasierklinge schneidet durch Maus und andere kleine Netzhaut. </li><li> Wie in Abb.. 1, tauchen die Netzhaut wieder in frische Ringer-Medium, mit oder ohne Testsubstanz mit einem 6-Platte gut (5 mL Ringer / well). Inkubieren der Netzhaut für 15 min bis zum Be-und Diffusion zu ermöglichen. </li><li> Dreimal für jeweils 5 min mit frischer Ringer-Medium mit oder ohne Testsubstanz. </li><li> Fix der Netzhaut mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Waschen mit 0,1 M PBS über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, reagieren wit 2% Streptavidin-Alexa 488 (Endkonzentration 10 ug / ml) in 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, und halten Sie über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 M PBS bei RT </li><li> In PBS, lösen die Netzhaut vom Filterpapier und dann mit einem feinen Pinsel, Ort der Netzhaut, orientiert Photorezeptor-Seite nach oben auf eine Folie. </li><li> Behutsam mit Vectashield Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zu montieren. </li><li> Nehmen Sie Bilder mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (zB Zeiss 510 META) bei gleicher Vergrößerung, Auflösung und Einstellungen für jede experimentelle Bedingung, so dass man die Auswirkungen der verschiedenen experimentellen Bedingungen (zB Test-Drogen; Lichtverhältnissen) vergleichen das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C). Obwohl ein einzelnes Bild all der markierten Zellen enthalten kann, ist es empfehlenswert, dass Sie ein z-Stapel im Bereich der Erhebung von Zinsen und Zusammenbruch in einen einzigenBild. </li></li></ol> 3. Die Quantifizierung der Tracer-Kopplung mit ImageJ <ol><li> In der LSM Image Browser, öffnen Sie das Bild, klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie das Bild als TIF-16 Bit nicht komprimierte Datei. Maßstabsbalken sollte in diesem TIF-Bild aufgenommen werden. </li><li> Mit NIH ImageJ Software, messen Fluoreszenzintensität Alexa-488-markierten neurobiotin von Low-Vergrößerungsbildern ganzer-mount Netzhaut. Öffnen Sie die TIF-Datei mit ImageJ Software und zeichnen Sie dann eine gerade Linie entspricht der Skala bar. Zur Analyse, SET SCALE und geben Sie die bekannte Strecke und die Einheit der Länge, klicken Sie dann auf OK. Jetzt Messergebnisse können in kalibrierten Einheiten wie Millimetern vorgestellt. </li><li> Wählen Sie den Bereich von Interesse, wobei die rechteckige Auswahl-Werkzeug. Der Höhepunkt der Fluoreszenz sollte am linken Rand der Auswahl positioniert werden. Stellen Sie sicher, dass es keine Fluoreszenzsignal in der Nähe des rechten Rand. Wenn nicht, drehen Sie das aktive Bild (Bild, dann drehen). </li><li> KlickenANALYSE und PLOT PROFILE. Sie sollten eine Kurve mit einem exponentiellen Abfall von links nach rechts zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf Kopieren in dem Popup-Fenster und fügen Sie ihn in EXCEL. Nun sehen Sie zwei Spalten zeigen die Entfernung aus dem Schnitt (linke Spalte) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes vom Schnitt (rechte Spalte). </li><li> Teilen Sie jeden Rohstoff Fluoreszenz-Wert durch die maximale Fluoreszenz Wert für die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. </li><li> Kopieren Sie zwei Spalten entsprechend dem Abstand von der Schnittkante (X) und die relative Fluoreszenzintensität (Y), und fügen Sie sie in Origin Software. </li><li> Fit mit dem exponentiellen Nr. 1 Funktion (Abb. 2D-und 4D-Bild.), Die in das Formular: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) wobei Y die relative Fluoreszenzintensität ist, Y o die Hintergrundfluoreszenz ist, Y max die maximale relative Fluoreszenz ist, ist λ die space (Länge) konstant, und x ist der Abstand von der Schnittkante. </li><li> Vergleichen Sie den Raum konstant (λ)-Werte bei verschiedenen experimentellen Bedingungen mit dem t-Test oder ANOVA (Abb. 2E und Abb.. 4E). Beachten Sie, dass alternative Techniken der Quantifizierung von anderen 13,14 beschrieben worden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Repräsentative Beispiele für Photorezeptorzelle Tracer Kopplung von cut-Laden bestimmt sind in den Abbildungen 2 und 3 (Fisch) und Abbildung 4 (Kaninchen) vorgestellt. Konfokale Bilder wurden mit den gleichen Einstellungen für den Vergleich (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes von der Schnittfläche aufgetragen und montiert durch die Exponentialfunktion in Ziffer 3.8 oben gezeigt (Abb. 2D und Bild. 4D). Raum konstante Werte für jede Bedingungsind in den Abbildungen 2E und 4E gezeigt, veranschaulicht, dass das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung quantifiziert werden mit Hilfe der Schnitt-loading-Technik sein. Darüber hinaus werden die Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar. Die Nutzung der Schnitt-loading-Technik als Mittel zur Quantifizierung der Umfang der Gap Junction-Tracer-Kopplung ist auch der Befund, dass die Fluoreszenz-Intensität exponentiell abnimmt als Funktion des Abstandes von der Schnitt in allen Fällen überprüft untersuchten 7,8 (siehe auch Abb.. 2D-und 4D hier), was darauf hinweist, dass neurobiotin die Photorezeptoren trat über die Rasierklinge geschnitten und nicht von anderen retinalen Seiten. Auch die qualitativ ähnliche Tag / Nacht-Unterschied in Photorezeptorzelle Tracer-Kopplung in Goldfische mit Tracer-Injektionen in einzelne Kegel und mit cut-loading 7 beobachtet begründet cut-Laden als ein relativ genaues Mittel zur Bestimmung des Ausmaßes der Photorezeptor-Kopplung. Der Cut-loading Technik kann auch verwendet werden, um andere Arten von elektrischen Synapsen in der Retina zu untersuchen. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5, dass Kaninchen A-Typ (Abb. 5A) und B-Typ (Abb. 5B) horizontale Zellen weisen homologe Tracer Kopplung folgenden Schnitt-loading und Verbreitung von neurobiotin unter dunkeladaptierten Bedingungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td> Fisch </td><td> Maus </td><td> Kaninchen </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 3,1 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1,2 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> - </td><td> 0,1 </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammensetzung der Ringer-Lösungen für Goldfische, Maus und Kaninchen Netzhaut. Die Konzentrationen sind in mM vorgestellt. Die Ringer-Lösungen werden mit 5% CO 2 / 95% O 2 Blasen und bei 22 ° C (Fisch) oder 36 ° C (Säugetiere). "-": Nicht in der Ringer für diese Spezies enthalten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1:. Flussdiagramm, das die cut-Ladevorgang. Nach der Isolierung of der intakten neuronalen Netzhaut wurden mehrere radiale Schnitte durch eine Klinge, die zuerst in 0,5% neurobiotin Lösung getaucht wurde gemacht. Die Netzhaut wurde für Tracer Be-und Diffusions-inkubiert, und dann vor der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gewaschen. Tracer-Kopplung wurde mittels Streptavidin-konjugierte Alexa-488. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Tag-Nacht-Unterschied in der Photorezeptor-Tracer-Kopplung in Goldfisch ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM), ein selektiver Dopamin-D 2-Rezeptor-Antagonist (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte (durch Pfeile angedeutet in AC). E) Space konstant valWerte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 4). *** P &lt;0,001. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein repräsentatives Beispiel zeigt Fluoreszenz in den Sehzellen Schicht eines dunkeladaptierten Goldfisch Netzhaut in der Nacht nach cut-Laden mit einer Lösung sowohl neurobiotin und Rhodamin Dextran. Rhodamin Dextran (rot dargestellt), die nicht durch offene Gap Junction Kanälen aufgrund seiner hohen Molekulargewicht (&gt; 10.000 MW), nur markierte Zellen in der Nähe der Schnitt ist diffus. Im Gegensatz dazu kann neurobiotin (grün dargestellt) verbreitet über Gap Junctions und in Sehzellen weit von dem Schnitt zu sehen. Die Lage des Schnittes wird durch den Pfeil in jedem Panel angezeigt. Maßstab: 200 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Tag-Nacht-UnterschiedePräsenz in Photorezeptor Tracer-Kopplung in Kaninchen Netzhaut ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM) (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). In AC, stehen senkrecht Ansichten der 3D-Rekonstruktion von Kaninchen-Photorezeptoren in der Nähe der Schnitt dargestellt. D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte. E) Space konstante Werte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 3). *** P &lt;0,001. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Cut-loading zeigt, dass dunkeladaptierten Kaninchen horizontalen Zellen sind Tracer gekoppelt. Beide A-Typs (A) und B-Typ (B) horizontale Zellen in dunkeladaptierten Kaninchen Netzhaut ausgestellt homologen neurobiotin Tracer-Kopplung.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li>
<li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li>
<li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li>
<li>Bloomfield, S. A., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li>
<li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li>
<li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li>
<li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li>
<li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li>
<li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li>
<li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Commun.+Adhes%22%5BJournal%5D)">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li>
<li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li>
<li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li>
<li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Schnitt-loading hier beschriebene Methode ist ein nützliches und einfach Technik, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu bestimmen. Vorteile dieser Technik sind die Fähigkeit, das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Retina unter einer Vielzahl von Beleuchtungs-Bedingungen zu quantifizieren während der Tag und Nacht und zu tun für die gekoppelte Neuronen, die mit kleinem Durchmesser Somata haben. Einschränkungen der Technik in das Studium der Gap Junctions in intaktem Gewebe fallen in zwei allgemeine Kategorien. Erstens kann Tracerdiffusion durch offene Gap Junctions relativ schwierig zu beobachten, durch a) den kleinen Durchmesser oder die Ladung mit den offenen Kanälen und b) die relativen Mengen von gekoppelten zellulären Kompartimenten 1,14,15 verbunden. Das heißt, Tracerdiffusion aus einer kleinen Zelle, um eine größere Zelle oder Gruppe von gekoppelten Zellen, compARED zu Tracerdiffusion aus einer größeren Zelle auf eine kleinere Zelle, kann schwieriger festzustellen, da Tracer Verdünnung. Zweitens, unter bestimmten physiologischen Bedingungen kann das Ausmaß der Tracer-Diffusion durch gap junctions in intaktem Gewebe nicht genau die Stärke der Lücke junctional Leitfähigkeit aufgrund der Unterschiede in der Leitfähigkeit von kleinen elektrischen Strom führenden Ionen, verglichen mit der Durchlässigkeit der relativ großen Tracer Moleküle 1,14,15. In der Regel Hinweise auf Tracer-Kopplung stark darauf hin, das Vorhandensein von funktionierenden, offenen Gap Junction Kanälen, sondern unter bestimmten physiologischen Bedingungen Tracerdiffusion kann nicht auftreten, oder beobachtet werden, obwohl elektrophysiologische Ableitungen der Anwesenheit von funktionierenden, offenen Gap Junctions vorschlagen. Es scheint wahrscheinlich, dass der Schnitt-loading-Technik kann auch verwendet werden, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Gewebe aus anderen Regionen des zentralen Nervensystems zu untersuchentem.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Tricaine Methansulfonat (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 mg / l gepuffert Aquarium Wasser </td></tr><tr><td> Urethane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 g / kgloading Dosis </td></tr><tr><td> Dual-Rohr Night Vision Goggle </td><td> Nacht Optics USA </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> Filter Paper, Grade Nr. 4 </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Pinzetten, Dumont Nr. 5, Biologie, 11 cm lang </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> Feine Schere, gefedert, 8 mm Klinge, gerade </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> Vektor </td><td> SP-1120 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Streptavidin-konjugierten Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran Rhodamin (hoch (&gt; 10.000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Vectashield Eindeckmedium </td><td> Vektor </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META Laser Scanning Konfokalmikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8,0 </td><td> OriginLab Corp </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-loading: ein nützliches werkzeug für die prüfung des umfangs der gap junction tracer kopplung zwischen netzhautneuronen

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Neben der chemischen synaptischen Übertragung, können Neuronen, die durch Gap Junctions miteinander verbunden sind auch schnell kommunizieren über elektrische synaptische Übertragung. Zunehmende Hinweise darauf, dass Gap Junctions ermöglichen nicht nur elektrischen Strom fließen und synchrone Aktivität zwischen miteinander verbundenen oder gekoppelten Zellen, sondern dass die Stärke oder die Wirksamkeit der elektrischen Kommunikation zwischen gekoppelten Zellen moduliert werden kann zu einem großen Teil 1,2. Darüber hinaus ermöglicht der große Innendurchmesser (~ 1,2 nm) von vielen Gap Junction Kanälen nicht nur elektrischen Strom fließen, sondern auch die Diffusion von intrazellulären Signalmolekülen und kleinen Metaboliten zwischen miteinander verbundenen Zellen, so dass Gap Junctions kann auch vermitteln, metabolische und chemische Kommunikation . Die Stärke der Lücke junctional Kommunikation zwischen Neuronen und deren Modulation durch Neurotransmitter und andere Faktoren können durch die gleichzeitige Aufnahme von elektrisch gekoppelt Zellen und durch die Bestimmung t untersucht werdenEr Ausmaß der Verbreitung von Tracer-Moleküle, die Gap Junction durchlässig sind, aber nicht durchlässige Membran nach iontophoretischen Injektion in einzelne Zellen. Allerdings können diese Verfahren äußerst schwierig, auf Neuronen mit kleinen Somata in intakten Nervengewebe führen. Zahlreiche Studien über elektrische Synapsen und die Modulation der elektrischen Kommunikation wurden in der Wirbeltier-Netzhaut durchgeführt worden, da jeder der fünf retinalen Neuronen-Typen erfolgt elektrisch über Gap Junctions 3,4 verbunden. Zunehmende Anzeichen hat gezeigt, dass die circadiane (24-Stunden-) Uhr in der Netzhaut und Veränderungen in Lichtstimulation Gap Junction Kopplung 3-8 regulieren. Zum Beispiel, haben neuere Arbeiten gezeigt, dass die Netzhaut circadianen Uhr Gap Junction Kopplung zwischen Stäbchen und Zapfen Sehzellen sinkt im Laufe des Tages durch die Erhöhung Dopamin D2-Rezeptor-Aktivierung und erhöht drastisch Stäbchen-Zapfen-Kopplung in der Nacht durch die Reduzierung D2-Rezeptor-Aktivierung <sup&gt; 7,8. Doch nicht nur diese Studien äußerst schwierig, auf Neuronen mit kleinen Somata in intakten neuronalen Retina führen, aber es kann schwierig sein, zur angemessenen Beherrschung der Lichtverhältnisse während der elektrophysiologischen Untersuchung einzelner retinaler Neurone auf Licht-induzierte Veränderungen in Gap Junction zu vermeiden Leitwert. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht. Dieser Schnitt-loading-Technik ist eine Modifikation des kratzen loading 9-12, die auf Farbstoff Be-und Diffusion durch offene Gap Junction Kanälen basiert. Scrape Laden funktioniert gut in kultivierten Zellen, aber nicht in dicke Scheiben schneiden, wie intakte Netzhaut. Der Schnitt-loading-Technik wurde verwendet, um Photorezeptor-Kopplung in intakten Fisch und Säugetier-Retina 7, 8,13 studieren, und kann verwendet werden, um studieren Kopplung zwischen seinanderen retinalen Neuronen, wie hier beschrieben.

Eine einfache und bequeme Methode, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen zu bestimmen, ist beschrieben. Diese Technik ermöglicht es, die Funktion der elektrischen Synapsen zwischen Nervenzellen im intakten Netzhaut unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu untersuchen.

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

Neben der chemischen synaptischen Übertragung können Neuronen, die über Gap Junctions verbunden sind, auch eine schnelle Kommunikation über elektrische synaptische ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Schnitt-Lade-Experiments besteht darin, das Ausmaß der Gap-Junction-Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in der intakten Netzhaut unter kontrollierten Beleuchtungsbedingungen zu untersuchen. Im ersten Schritt werden Netzhäute mit einer scharfen Klinge geschnitten, die in eine Lösung aus Neurobiotin, einem Tracermolekül, das durch offene Gap-Junction-Kanäle, jedoch nicht durch Zellmembranen diffundieren kann, getaucht wurde. Im zweiten Schritt werden die Netzhäute in Ringer-Lösung inkubiert, wodurch die Diffusion des Tracers durch offene Gap-Junction-Kanäle ermöglicht wird.Wenn die Gap-Junction-Kopplung schwach ist, bleibt die Neurobiotin-Fluoreszenz auf Netzhautneuronen beschränkt, die nahe dem Schnitt liegen. Im Gegensatz dazu wird die Fluoreszenz bei starker Gap-Junction-Kopplung in Netzhautneuronen weit entfernt vom Schnitt nachgewiesen. Der Hauptvorteil der Schnittbeladung gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass sie leichter an Neuronen mit kleinen Zellkörpern im intakten neuralen Netzhautgewebe durchzuführen ist.Es ist außerdem einfacher, die Beleuchtungsbedingungen während der Schnittbeladung zu kontrollieren als während einer elektrophysiologischen Untersuchung einzelner Neuronen im intakten Netzhautgewebe. Da die Lichtreize, die während der elektrischen Aufzeichnung verwendet werden, selbst zu Veränderungen in der Gap-Junction-Kopplung führen können, wird die Technik von Dr. Chu Choi, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Bei diesem Verfahren wird ein Goldfisch vor der Operation tagsüber mindestens eine Stunde lang in konstantem Dunkel gehalten, und alle folgenden Schritte bis zur Fixierung des Netzhautgewebes werden ebenfalls tagsüber im konstanten Dunkel durchgeführt; der Goldfisch wird tief anästhesiert, indem 150 Milligramm pro Liter Methansulfonat dem Aquarienwasser zugesetzt werden.Anschließend die Goldfische gemäß den bundesstaatlichen und universitären Richtlinien töten und die Augäpfel vorsichtig entfernen. Danach den vorderen Teil jedes Augapfels entfernen. Anschließend ein Stück Filterpapier auf den hinteren Teil des Auges legen und das Filterpapier zusammen mit dem Auge umdrehen, sodass sich das Filterpapier unterhalb des hinteren Teils des Auges befindet.Entfernen Sie nun vorsichtig die Augenhinterseite einschließlich der Sklera und des Pigmentepithels von der dunkeladaptierten Goldfisch. Retina durchtrennen Sie den Sehnerv mit einer feinen Schere. Die isolierte Netzhaut des Goldfisches, mit der Photorezeptorseite nach oben ausgerichtet, sollte vor der Enukleation an dem Filterpapier befestigt sein, während der Fisch unter Narkose steht, in fünf Milliliter sauerstoffhaltiger, carbonathaltiger Ringer-Lösung mit oder ohne Testsubstanz pro Vertiefung einer sechs-well-Platte nach der Präparation der intakten neuralen Netzhaut aus dem hinteren Augenabschnitt.Überführen Sie die Netzhäute während konstanter Dunkelheit in die Vertiefungen. Versiegeln Sie anschließend die Vertiefungen mit Paraform und lassen Sie das Gewebe 30 Minuten inkubieren. Bereiten Sie 100 Mikroliter Tracerlösung vor, indem Sie 0,5 % Neurobiotin unmittelbar vor dem Durchschneiden der Netzhaut in Ringer-Lösung auflösen.Fügen Sie als Nächstes die Neuro-Biotin-Lösung einer Glas-Petrischale hinzu. Dann klopfen Sie vorsichtig das Filterpapier, an dem die Retina befestigt ist, auf ein Papierhandtuch, um überschüssiges Ringer-Lösung zu entfernen. Tauchen Sie eine Rasierklinge in die Neuro-Biotin-Lösung und führen Sie damit einen senkrechten radialen Schnitt durch die Retina und das Filterpapier.Danach tauchen Sie die Rasierklinge erneut in die Neuro-Biotin-Lösung und schneiden die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie dies bis zu viermal pro Netzhaut. Überführen Sie die Netzhaut in diesem Schritt in frisches Ringer-Medium mit oder ohne Testsubstanz für 15 Minuten, um das Beladen und die Diffusion zu ermöglichen.Waschen Sie sie dreimal mit frischem Ringer-Medium, mit oder ohne Testsubstanz, jeweils fünf Minuten lang. Anschließend fixieren Sie die Netzhaut mit 4 % Paraformaldehyd in 0,1-molarer Phosphatpufferlösung bei Raumtemperatur für eine Stunde. Danach waschen Sie die Netzhaut über Nacht mit 0,1-molarer PBS bei vier Grad Celsius, indem Sie sie am folgenden Tag in einen Kühlschrank stellen.Reagieren Sie die Netzhaut mit 2 % Streptavidin-Alexa-488 in 0,1 molarem PBS und 0,3 % Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Netzhaut dreimal mit 0,1 molarem PBS bei Raumtemperatur, jeweils zehn Minuten lang.Lösen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier in PBS ab. Bringen Sie die Netzhaut dann mithilfe eines feinen Pinsels mit der Photorezeptorseite nach oben auf einem Objektträger mit Vector-Shield-Montagemedium an. Übertragen Sie den Objektträger auf ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop und nehmen Sie Aufnahmen mit derselben Vergrößerung, Auflösung und Einstellungen für jede experimentelle Bedingung vor, um Vergleiche der Auswirkungen unterschiedlicher experimenteller Bedingungen auf das Ausmaß der Lückenfunktionstracer-Kopplung anstellen zu können, wie gezeigt.Hier ist das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern während des Tages im konstanten Dunkel im Vergleich zum Tag im konstanten Dunkel in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D2-Rezeptor-Antagonisten. Beachten Sie, dass der Rasierschnitt in beiden Bildern links ist. Obwohl ein einzelnes Bild alle markierten Zellen enthalten kann, wird empfohlen, einen Z-Stack des interessierenden Bereichs aufzunehmen und diesen zu einem einzigen Bild zusammenzufassen, wie gezeigt.Hier ist das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern dargestellt, wenn man nacheinander einen solchen Zack durchläuft. Beachten Sie, dass der Rasiererschnitt auf der rechten Seite dieses Bildes liegt. Um das Ausmaß der Tracerkopplung im LSM-Bildbetrachter zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild, klicken Sie dann auf „Exportieren“ und speichern Sie das Bild als nicht komprimierte TIF-Datei mit 16 Bit; die Maßstabsleiste sollte mithilfe der NIH-Image-J-Software in dieses TIFF-Bild eingefügt werden.Messen Sie die Fluoreszenzintensität von Alexa 488-markiertem Neurobiotin anhand von Aufnahmen von retinalen Lochpräparaten mit niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung. &Ouml;ffnen Sie die TIFF-Datei mit der ImageJ-Software und zeichnen Sie eine gerade Linie, die der Skalierungsleiste entspricht. Gehen Sie anschlie&szlig;end zu Analysieren, Skalierung festlegen und geben Sie die bekannte Distanz und L&auml;ngeneinheit ein.Dann klicken Sie auf „Okay“. Nun können die Fluoreszenzmessungen in kalibrierten Einheiten wie Millimeter dargestellt werden. Danach wählen Sie den interessierenden Bereich mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug aus.Der Peak der Fluoreszenz sollte sich am linken Rand Ihrer Auswahl befinden. Stellen Sie sicher, dass sich in der Nähe des rechten Rands kein Fluoreszenzsignal befindet. Klicken Sie auf „Analysieren“ und „Profil plotten“ für die tagsüber erhaltenen Kontrolldaten unter konstanter Dunkelheit.Eine Kurve mit exponentiellem Abfall wird von links nach rechts dargestellt. Klicken Sie dann im Popup-Fenster auf Kopieren und fügen Sie sie in Excel ein. Nun liegen zwei Spalten vor, von denen eine den Abstand zum Schnitt und die andere die Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstands zum Schnitt anzeigt.Zum Vergleich werden die obigen Schritte mit Daten wiederholt, die tagsüber unter konstanter Dunkelheit gewonnen wurden. In Gegenwart von Spit bro dividieren Sie jeden Rohfluoreszenzwert durch den maximalen Fluoreszenzwert, um die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. Kopieren Sie zwei Spalten, die der Entfernung vom Schnitt und der relativen Fluoreszenzintensität entsprechen, und fügen Sie diese anschließend in die Origin-Software ein.Diese Schritte werden sowohl für die Tageskontrolle als auch für die Tagesprobe gezeigt. Passen Sie die Daten an diesem Punkt mit der exponentiellen Abnahme-Funktion an und vergleichen Sie die Werte der räumlichen Konstante unter verschiedenen experimentellen Bedingungen mithilfe eines T-Tests oder einer Inova.Exponentielle Funktionen und statistische Analysen der Daten von Tageskontrollen, Tages-Pipron-Daten und Nachtkontrollen werden zum Vergleich gezeigt. Hier sind Beispiele für das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern in der dunkeladaptierten Goldfischretina am Tag A, in der Nacht B und tagsüber in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D2-Rezeptor-Antagonisten, wie sie mit der Cut-Loading-Technik sichtbar gemacht wurden. Alle konfokalen Aufnahmen wurden unter identischen Einstellungen aufgenommen, um einen Vergleich zu ermöglichen.In dieser Grafik wird die Fluoreszenzintensität für drei experimentelle Bedingungen als Funktion des Abstands vom Schnitt dargestellt und mittels einer exponentiellen Funktion angepasst. Die Schnittlade-Technik wird verwendet, um das Ausmaß der gap-junctionalen Tracer-Kopplung zu quantifizieren, indem Raumkonstantenwerte berechnet werden, wie hier für drei experimentelle Bedingungen gezeigt. Die Schnittlade-Technik kann auch genutzt werden, um die elektrischen Synapsen zwischen anderen Zelltypen in der Netzhaut und bei anderen Arten zu untersuchen.Beispielsweise veranschaulichen diese beiden Abbildungen, dass horizontale Zellen vom A-Typ und B-Typ bei Kaninchen unter dunkeladaptierten Bedingungen eine homologe Trägerkopplung nach Schnittbeladung und Diffusion von Neurobiotin aufweisen. Mithilfe der Schnittbeladungstechnik haben wir das Ausmaß der Trägerdiffusion über die Nexusstellen zwischen Stäbchen und Zapfen tagsüber und nachts untersucht. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um festzustellen, ob die Trägerkopplung zwischen anderen Netzhautneuronen durch die Netzhautuhr und/oder durch bestimmte Hell-Dunkel-Bedingungen reguliert wird.Es kann auch verwendet werden, um die Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in anderen Hirnregionen zu untersuchen.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.

Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Hier beschreiben wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf in die Nervenendigungen. Wir stellen auch ein Protokoll für die Aufzeichnung und Analyse von schnellen Calcium-Transienten in den peripheren Nervenenden vor.

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Organisation der astrocytic Netzwerke zu beurteilen. Das beschriebene Verfahren minimiert Vorspannung um beschreibende Maßnahmen dieser Netze z. B. Zellzahl, Größe, Umgebung und Position innerhalb eines Kerns zu bieten. Anisotropie ist mit einer vektoriellen Analyse bewertet.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Lücke Kreuzung interzelluläre Kommunikation Assay für den Hochdurchsatz-Screening von Lücke Kreuzung modulierende Chemikalien für die Arzneimittelforschung und toxikologische Bewertung entwickelt.

Ein Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction-interzelluläre Kommunikation Assay

In dieser Arbeit wird ein alternatives Flatmount-Retina-Präparat vorgestellt, bei dem die Entfernung von Photorezeptor-Zellkörpern eine schnellere Antikörperdiffusion und einen verbesserten Patch-Pipettenzugang zu inneren Netzhautneuronen für Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Split Retina als verbessertes Flatmount-Präparat zur Untersuchung von Neuronen der inneren Kernschicht in der Netzhaut von Wirbeltieren

Erfahren Sie die Cut-Loading-Methode zur Untersuchung der Gap-Junction-Kopplung zwischen Netzhautneuronen. Diese Technik ermöglicht die Analyse elektrischer Synapsen unter kontrollierten Lichtbedingungen.

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

Weitere Videos entdecken