Intranasale Verabreichung von siRNA an das Gehirn von Mäusen mit Hilfe eines Positionierungsgeräts

Beginnen Sie mit anästhesierten Mäusen, die auf ein Positionierungsgerät gelegt werden, wobei ihr Rücken parallel zur Rückenlehne des Stuhls und senkrecht zum Sitz steht.

Die Mäuse werden in einer Kopf-und-Vorwärts-Haltung positioniert und mit Stuhlgurten gesichert.

Platzieren Sie mit einer Mikropipette, die mit einem Neuronen-Targeting-Peptid-siRNA-Komplex beladen ist, einen Tropfen in der Nähe eines Nasenlochs, damit die Maus die Lösung auf natürliche Weise einatmen kann.

Drücken Sie den Kopf der Maus während der Inhalation vorsichtig nach unten, um zu verhindern, dass die Lösung in die Lunge abfließt.

Halten Sie kurz inne, wiederholen Sie dann die Verabreichung im anderen Nasenloch.

Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Mäuse.

Der Komplex dringt in die Nasenschleimhaut ein, von wo aus er in die Riech- und Trigeminusnerven eindringt und durch diese hindurch zum Gehirn gelangt.

Im Gehirn bindet der Komplex an neuronale Rezeptoren, durchläuft eine Endozytose und erleichtert die intrazelluläre siRNA-Verabreichung.

Die siRNA wird Teil des RISC-Komplexes, der bei Bindung an die Ziel-mRNA das Gen-Silencing induziert.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, beurteilen Sie den Anästhesiegrad des zweibeinigen Reflexes der Maus, um die chirurgische Ebene beizubehalten. Platzieren Sie anschließend das Positioniergerät in einem geeigneten Abstand und in geeigneter Höhe, um einen bequemen Zugang zu allen erforderlichen Reagenzien zu ermöglichen.

Tragen Sie dann Salbe auf die Augen des Tieres auf. Schnallen Sie eine Maus mit Stuhlgurten an und stellen Sie sicher, dass die Vordergliedmaßen der Maus in einer entspannten Position ohne Beschwerden natürlichen Halt bieten. Wiederholen Sie die Verfahren für die restlichen Mäuse. Platzieren Sie jede Maus vorsichtig auf dem dafür vorgesehenen Stuhl, indem Sie ihre Rückenlehne parallel zur Rückenlehne des Stuhls und in einem Winkel von 90 Grad zum Stuhlsitz legen.

Lassen Sie das Tier natürlich in der Kopf-, Ab- und Vorwärtsposition liegen, ohne zu drücken oder zu drücken. Sobald alle Mäuse festgeschnallt sind, beginnen Sie sofort mit der intranasalen Inokulation. Um eine intranasale Verabreichung durchzuführen, beladen Sie die Mikropipette mit 2 Mikrolitern RVG9R-siRNA-Komplexlösung. Halten Sie die Pipette in der dominanten Hand und stützen Sie sie mit der anderen Hand ab, um unkontrollierte Bewegungen bei der Verabreichung von siRNA zu vermeiden.

Platzieren Sie etwa einen 2-Mikroliter-Tropfen sehr nahe an einem Nasenloch, damit die Maus ihn direkt einatmen kann. Wenn sich ein winziger Tropfen nicht leicht bilden lässt, ersetzen Sie die Pipettenspitze durch eine neue und wiederholen Sie den Vorgang. Drücken Sie den Mauskopf während des Einatmens vorsichtig 5 Sekunden lang mit dem Zeigefinger nach unten und halten Sie die Position.

Um zu verhindern, dass das Medikament in die Lunge abfließt, ist es wichtig, den Mauskopf 5 Sekunden lang mit dem Zeigefinger leicht nach unten zu drücken, während die Maus inhaliert.

Starten Sie eine Stoppuhr, um drei bis vier Minuten danach zu messen, um die Inokulation in die zweite Nare der ersten Maus zu timen. Dieses Zeitintervall ist notwendig, damit die Maus die Inhalation der ersten Dosis abschließen und die normale Atmung wiederherstellen kann. In dem drei- bis vierminütigen Intervall zwischen der Inokulation der abwechselnden Nasenlöcher bei der ersten Maus wird die intranasale Inokulation von je einer Nare bei jeder der verbleibenden drei Mäuse, die auf dem Gerät platziert werden, abgeschlossen.

Wenn die Stoppuhr ertönt, impfen Sie das zweite Nasenloch der ersten Maus und wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Mäuse wie oben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die 20 bis 30 Mikroliter für alle vier Mäuse abgegeben sind. Es dauert etwa 30 bis 45 Minuten, bis der gesamte Impfvorgang abgeschlossen ist. Bringen Sie die Tiere in die dafür vorgesehenen Käfige zurück. Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten.