Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine linsenlose, chipbasierte Fluoreszenzmikroskopieplattform zur Abbildung fluoreszierender Objekte über ein extrem weites Sichtfeld zu demonstrieren. Zu diesem Zweck werden ein dünner Absorptionsfilter und eine faseroptische Bildwand vorsichtig auf einem optoelektronischen Sensorarray, oder CCDC moss, platziert, woraufhin ein mikrofluidischer Chip auf der Bildwand positioniert wird. Anschließend wird ein Prisma mithilfe von brechungsindexanpassendem Öl mit dem Mikrochip verbunden.

Die fluoreszente Anregung erfolgt über die Seitenfläche eines rhombischen Prismas, und die holografische Beleuchtung wird über die obere Fläche desselben Prismas durchgeführt. Letztendlich können hochauflösende mikroskopische Bilder aus den aufgenommenen Fluoreszenzbildern gewonnen werden, indem die Rohbilder mithilfe digitaler Algorithmen decodiert werden. Falls erforderlich, können die decodierten fluoreszenten Objekte automatisch mit einer eigens entwickelten Schnittstelle gezählt werden.

Objektiv auf Chip. Die Bildgebung zielt im Allgemeinen darauf ab, sperrige, objektivbasierte optische Mikroskope durch einfachere und kompaktere Designs zu ersetzen. Diese neuartige Technologieplattform hat das Potenzial, den Bedarf an sperrigen und kostspieligen Bauteilen mithilfe neuartiger Theorien und digitaler Rekonstruktionsalgorithmen zu eliminieren.

Die Linsenliste auf der On-Chip-Bildgebungsplattform umfasst mehrere optische Komponenten, darunter ein digitales Sensorsystem, eine inkohärente Beleuchtungsquelle, ein Prisma, einen Absorptionsfilter sowie eine faseroptische Abdeckplatte oder einen faseroptischen Taper. Auf dieser Plattform können verschiedene Arten von Sensorsystemen zur Detektion des Fluoreszenzsignals von Zielmikroobjekten eingesetzt werden. Für dieses Video wird ein CCD-Chip (charge coupled device) verwendet; zur Anregung der Fluoreszenz dient eine inkohärente Lichtquelle, beispielsweise eine einfache Leuchtdiode.

Es werden zwei verschiedene Anregungsfiltermethoden parallel eingesetzt, um den erforderlichen Dunkelfeldhintergrund zu erzeugen, wie in diesem Diagramm dargestellt. Zunächst wird ein Glasprisma oder eine Glashalbkugel verwendet, um eine totale innere Reflexion oder TIR an der Unterseite des mikrofluidischen Chips zu erzeugen, der die interessierenden Proben enthält. Parallel dazu wird ein kostengünstiger Absorptionsfilter eingesetzt, um das schwach gestreute Anregungslicht zu entfernen, das dem TIR-Prozess nicht folgt.

Nach erfolgreicher Unterdrückung der Anregung durch diese beiden Mechanismen wird am Detektorebene ausschließlich die Fluoreszenzemission der Proben erfasst. Trotz einer so großen numerischen Apertur der Detektion werden die rohen Fluoreszenzpunkte am Sensorarray ziemlich breit, um die räumliche Ausbreitung dieses Fluoreszenzsignals gezielt zu gestalten und besser zu kontrollieren. Als Alternative zu einer herkömmlichen Abdeckplatte wird eine faseroptische Abdeckplatte zwischen der Objekt- und der Sensorebene platziert.

Eine kegelförmige faseroptische Abdeckplatte, die auf ihrer oberen Fläche eine deutlich höhere Dichte an faseroptischen Kabeln aufweist als auf der unteren, kann zur hochauflösenden Bildgebung durch Vergrößerung verwendet werden. Die mikrofluidischen Chips, die in dieser Plattform eingesetzt werden, werden hergestellt, indem Polydimethylsiloxan-Wände auf Objektträgern aus Glas angebracht werden, um die Mikrokanäle zu bilden, die für die chipbasierte Bildgebung erforderlich sind, um den Aufbau der kontaktlosen chipbasierten Bildgebungsplattform zu beginnen. Entfernen Sie zuerst das Deckglas des optoelektronischen Sensorarrays mithilfe eines Vakuumstifts und legen Sie vorsichtig einen dünnen Absorptionsfilter auf den aktiven Bereich des Detektors.

Platzieren Sie eine faseroptische Abdeckplatte auf diesem Absorptionsfilter. Danach setzen Sie den hergestellten mikrofluidischen Chip direkt auf das faseroptische Array. Anschließend wird ein Glasprisma oberhalb des mikrofluidischen Chips mit Hilfe von Immersionsöl montiert, sodass der Brechungsindex der Grenzfläche mit dem Brechungsindex des Glases übereinstimmt.

Verbinden Sie die Lichtquellen mithilfe von FC-Steckern mit den Glasfaserkabeln. Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Ausrichtung der Komponenten. Richten Sie sorgfältig die Abstände zwischen den Komponenten sowie die Position und den Winkel der Beleuchtung aus.

Bewegen Sie schließlich die Seiten-Illuminationsfaser näher an das Prisma heran und justieren Sie ihren Winkel, um eine totale innere Reflexion an der Grenzfläche zwischen Glas und Luft sicherzustellen, die den mikrofluidischen Chips entspricht. Mit dieser Chip-basierten Plattform können der untere Substratbereich, verschiedene Zellen oder kleine Tiermodelle abgebildet werden, für die vorliegende Demonstration jedoch werden weiße Blutkörperchen abgebildet. Um die weißen Blutkörperchen mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren, mischen Sie zunächst etwa 100 Mikroliter Vollblut mit etwa einem Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen, inkubieren Sie etwa drei Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie anschließend die lysierte Blutlösung.

Nachdem die obere Schicht mithilfe einer Mikropipette entfernt wurde, das Pellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendieren, um die Nukleinsäuren der Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren; fügen Sie anschließend SYTO 16 zur Resuspension hinzu und inkubieren Sie die Probe etwa 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die markierte Probe. Entfernen Sie das Überstand, um die Hintergrundsignalstärke aufgrund der Fluoreszenzemission ungebundener Farbstoffe zu verringern.

Reese hat den Pellet der weißen Blutkörperchen in etwa fünf Milliliter PBS resuspendiert. Die Probe ist nun bereit, in den mikrofluidischen Chip für die linsenfreie, chipbasierte fluoreszenzoptische Bildgebung geladen zu werden. Vor der Bildgebung der weißen Blutkörperchen muss die Bildgebungsplattform mithilfe fluoreszierender Mikroperlen kalibriert werden.

Bereiten Sie eine verdünnte Mikroperlenprobe unter Verwendung von entionisiertem Wasser und der rohen Perlenlösung vor. Injizieren Sie diese Ausgangsprobe mithilfe einer scharfen Nadel und einer Spritze in den mikrofluidischen Chip von der Seite der PDMS-Wände aus.

Nachdem die Komponenten zur Durchführung der fluoreszenzbasierten On-Chip-Bildgebung zusammengestellt wurden, gewinnen Sie Rohbilder fluoreszierender Kügelchen mithilfe der eigens entwickelten LabView-Schnittstelle über einen Computer. Stellen Sie sicher, dass mindestens 20 isolierte Bilder fluoreszierender Kügelchen über das gesamte Sichtfeld verteilt vorhanden sind. Speichern Sie die Kalibrierungsdaten, die später zur Kalibrierung und Extraktion der punktverbreiternden Funktion (Point Spread Function) der linsenlosen fluoreszenzbasierten Mikroskopieplattform verwendet werden.

Entfernen Sie den mikrofluidischen Chip, der die Probe mit fluoreszierenden Kügelchen enthält, und lösen Sie das Prisma von diesem Chip. Injizieren Sie die zuvor vorbereitete Probe von weißen Blutkörperchen in einen anderen unbenutzten mikrofluidischen Chip von der Seite der PDMS-Wände. Bauen Sie die Komponenten erneut unter denselben experimentellen Bedingungen zusammen, insbesondere hinsichtlich der Abstände und der Anregungsleistung.

Erfassen Sie die Rohbilder von weißen Blutkörperchen mithilfe der benutzerdefinierten Lab-Ansicht mit denselben Softwareparametern, die auch für die fluoreszierenden Mikroperlen verwendet wurden. Die Kalibrierungsdaten und die Rohbilder der weißen Blutkörperchen werden anschließend in MATLAB durch digitale Verarbeitung genutzt, um Bilder mit höherer Auflösung zu erstellen. Hier sind repräsentative Ergebnisse der Weitfeldlinsen-Fluoreszenz-Auf-Chip-Bildgebung einer Mischung, die vier Mikrometer und 10 Mikrometer große grün fluoreszierende Partikel enthält, zu Vergleichszwecken dargestellt, 10×-Mikroskop.

Es werden auch objektive Bilder bereitgestellt, die gut mit den linsenlosen fluoreszierenden Aufnahmen übereinstimmen. Als Nächstes folgen Ergebnisse der Weitfeld-linsenlosen Fluoreszenzbildgebung einer Mischung, die 10 µm grüne und 10 µm rote fluoreszierende Partikel enthält. Die linsenlosen fluoreszierenden Bilder stimmen gut mit Aufnahmen desselben Probenmaterials mit einem 10×-Mikroskopobjektiv überein.

Diese Abbildung zeigt einen Leistungsvergleich der Lucy-Richardson-Dekonvolution und der kompressiven Abtastung basierend auf Dekodierungsalgorithmen zur Abbildung verschiedener 10-Mikrometer-Perlenpaare. Die obere Zeile zeigt die rohen fluoreszenten bilder ohne Objektiv, wobei die eingeblendeten Bilder die mikroskopischen Vergleiche derselben Partikel darstellen, die mit einem 10×-Objektiv erforderlich sind. Die mittlere Zeile zeigt die Ergebnisse der kompressiven Dekodierung, während die untere Zeile die Ergebnisse der Lucy-Richardson-Dekonvolution darstellt. DDCS und DLR beziehen sich jeweils auf die Abstände von Zentrum zu Zentrum sowie auf die Mikroskopbilder, CS-dekodierte objektivbasierte Bilder und LR-dekonvolvierte objektivfreie Bilder.

Anschließend wird die digitale Verarbeitung von Linsen, weniger fluoreszierenden Rohbildern, veranschaulicht. Ein auf kompressiver Abtastung basierender Algorithmus wird verwendet, um eine räumliche Auflösung von weniger als vier Mikrometern zu erreichen, indem eng beieinander liegende Paare von zwei Mikrometer durchmessenden Perlen aufgelöst werden. Die Einlegetafeln zeigen Vergleiche mit einem 40×-Mikroskopobjektiv, die sehr gut mit den decodierten fluoreszierenden Bildern übereinstimmen.

Hier bezeichnet D die Abstände von Mittelpunkt zu Mittelpunkt in Mikroskopaufnahmen. Während sich DCS auf die Abstände von Mittelpunkt zu Mittelpunkt in der CS-dekodierten Linse bezieht, bei weniger fluoreszierenden Bildern. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der abbildungsfreien Aufnahme von fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen.

Die rohen, linsenfreien Bilder werden mithilfe eines auf kompressiver Abtastung (CS) basierenden Dekodierers schnell decodiert, was sehr gut mit einem herkömmlichen Mikroskopbild derselben Probe übereinstimmt, das mit einem 10×-Objektiv aufgenommen wurde. Zusätzlich zur Bildgebung können die decodierten fluoreszierenden Objekte bei Bedarf auch automatisch gezählt werden, und zwar über eine eigens entwickelte Schnittstelle für On-Chip-Zytometrie-Anwendungen. Hier ist eine speziell konzipierte, automatisierte Schnittstelle zur Zählung fluoreszierender Objekte in Matlab dargestellt. Soeben haben wir das Verfahren zur linsenfreien Fluoreszenzmikroskopie markierter Zellen und mikroskopischer Partikel über ein Sichtfeld von acht Quadratzentimetern demonstriert.

Eine solche verglichene Schiffsabbildungsplattform mit dem schnellen kompressiven Decoder dahinter wird für Anwendungen in der Hochdurchsatz-Zytometrie, der Analyse seltener Mikroobjekte und der Erforschung echter Zellen recht variabel sein.