Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine linsenlose On-Chip-Fluoreszenzmikroskopie-Plattform für die Abbildung fluoreszierender Objekte über ein ultraweites Sichtfeld zu demonstrieren. Um dies zu erreichen, werden ein dünner Absorptionsfilter und eine faseroptische Frontplatte vorsichtig auf ein optoelektrisches Sensorarray oder CCDC-Moos gelegt, und dann wird ein mikrofluidischer Chip auf der Frontplatte positioniert. Als nächstes wird ein Prisma mit dem Mikrochip unter Verwendung von Index-Matching-Öl zusammengebaut.

Die fluoreszierende Zitierung wird durch die seitliche Facette eines rhomboiden Prismas erreicht, und die holographische Beleuchtung erfolgt durch die obere Facette desselben Prismas. Letztendlich können aus den aufgenommenen Fluoreszenzbildern hochauflösende mikroskopische Bilder gewonnen werden, indem die Rohbilder durch digitale Algorithmen dekodiert werden. Bei Bedarf können die dekodierten fluoreszierenden Objekte über eine eigens entwickelte Schnittstelle automatisch gezählt werden.

On-Chip-Linse. Die Bildgebung im Allgemeinen zielt darauf ab, sperrige, linsenbasierte optische Mikroskope durch einfachere und kompaktere Designs zu ersetzen. Diese aufstrebende Technologieplattform hat das Potenzial, mit Hilfe neuartiger Theorien und digitaler Rekonstruktionsalgorithmen den Bedarf an sperrigen und kostspieligen Attraktivitätskomponenten zu eliminieren.

Die Linsenliste auf der On-Chip-Bildgebungsplattform umfasst mehrere optische Komponenten, darunter ein digitales Sensorarray, eine inkohärente Beleuchtungsquelle, ein Prisma, einen Absorptionsfilter und eine faseroptische Frontplatte oder einen faseroptischen Konus. Auf dieser Plattform können verschiedene Arten von Sensorarrays zur Detektion des Fluoreszenzsignals von Zielmikroobjekten verwendet werden. Für die Zwecke dieses Videos wird eine ladungsgekoppelte Vorrichtung verwendet, bei der eine inkohärente Lichtquelle, wie beispielsweise eine einfache Leuchtdiode, zur Fluoreszenzanregung verwendet wird.

Zwei verschiedene Anregungsfiltermethoden werden parallel verwendet, um den erforderlichen Dunkelfeldhintergrund zu erzeugen, wie in diesem Diagramm gezeigt. Zunächst wird ein Glasprisma oder eine Glashalbkugel verwendet, um eine Totalreflexion oder TIR an der Unterseite des mikrofluidischen Chips zu erzeugen, der die interessierenden Proben enthält. Parallel dazu wird ein kostengünstiger Absorptionsfilter eingesetzt, um die wöchentlich gestreuten Anregungslichter zu entfernen, die dem TIR-Verfahren nicht gehorchen.

Nach erfolgreicher Ablehnung der Anregung mit diesen beiden Mechanismen wird nur die Fluoreszenzemission der Proben in der Detektorebene erfasst. Trotz einer so großen numerischen Apertur werden die rohen Fluoreszenzflecken am Sensorarray ziemlich breit, um die räumliche Ausbreitung dieses Fluoreszenzsignals zu manipulieren und besser zu steuern. Eine faseroptische Frontplatte wird als Alternative zu einer normalen Frontplatte zwischen dem Objekt und den Sensorebenen platziert.

Eine konische Glasfaser-Frontplatte, die auf ihrer oberen Facette im Vergleich zur unteren Facette eine deutlich größere Dichte an Glasfaserkabeln aufweist, kann durch Vergrößerung für eine höher aufgelöste Bildgebung verwendet werden. Die mikrofluidischen Chips, die in dieser Plattform verwendet werden, werden unter Verwendung von Polydimethyl-Sloane-Wänden hergestellt, die auf Glasobjektträgern platziert sind, um die Mikrokanäle zu erzeugen, die für die On-Chip-Bildgebung benötigt werden, um mit der Montage der landlosen On-Chip-Bildgebungsplattform zu beginnen. Entfernen Sie zunächst das Deckglas des optoelektronischen Sensorarrays mit einem Vakuumstift und platzieren Sie vorsichtig einen dünnen Absorptionsfilter auf der Oberseite des aktiven Bereichs des Detektors.

Positionieren Sie eine faseroptische Frontplatte auf diesem Absorptionsfilter. Platzieren Sie dann den hergestellten mikrofluidischen Chip direkt auf dem Glasfaserarray. Als nächstes wird ein Glasprisma über dem mikrofluidischen Chip montiert, wobei der Brechungsindex der Grenzfläche mit dem Brechungsindex des Glases abgestimmt ist.

Verbinden Sie die Lichtquellen mit Glasfaserkabeln durch die Verwendung von FC-Steckern. Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Ausrichtung der Komponenten. Richten Sie die Abstände zwischen den Komponenten, die Position und den Winkel der Beleuchtung sorgfältig aus.

Bewegen Sie schließlich die Faser der seitlichen Beleuchtung näher an das Prisma heran und stellen Sie ihren Winkel so ein, dass eine interne Totalreflexion an der Glas-Luft-Grenzfläche auftritt, die den mikrofluidischen Chips entspricht. Mit dieser On-Chip-Plattform können Bodensubstrat, verschiedene Zellen oder Kleintiermodelle abgebildet werden, aber weiße Blutkörperchen werden für die Zwecke dieser Demonstration abgebildet. Um die weißen Blutkörperchen mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, mischen Sie zunächst etwa 100 Mikroliter Vollblut mit etwa einem Milliliter aufsteigendem Puffer der roten Blutkörperchen, inkubieren Sie etwa drei Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann die Blutlösung.

Nachdem Sie die oberste Schicht mit einer Mikropipette entfernt haben, resuspendieren Sie die Pelletschicht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die Nukleinsäure der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, fügen Sie SYTO 16 zur Reanimationssuspension hinzu und inkubieren Sie die Probe dann etwa 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die markierte Probe. Entfernen Sie das Supinat, um das Hintergrundrauschen aufgrund der Fluoreszenzemission von ungebundenen Farbstoffen zu verringern.

Reese hat die Pelletschicht der weißen Blutkörperchen in etwa fünf Millilitern PBS gebogen. Die Probe ist nun bereit, in den mikrofluidischen Chip geladen zu werden, um eine linsenfreie On-Chip-Fluoreszenzbildgebung zu ermöglichen. Vor der Bildgebung der weißen Blutkörperchen muss die Bildgebungsplattform mit fluoreszierenden Mikrokügelchen kalibriert werden.

Bereiten Sie eine verdünnte Mikrokügelchenprobe mit deionisiertem Wasser und roher Bead-Lösung vor. Mit einer scharfen Nadelspritze. Injizieren Sie diese erste Probe von der Seite der PDMS-Wände in den mikrofluidischen Chip.

Nachdem Sie die Komponenten zusammengebaut haben, um eine On-Chip-Fluoreszenzbildgebung zu erzielen, erfassen Sie Rohbilder von fluoreszierenden Kügelchen mit der speziell entwickelten Laboransichtsschnittstelle über einen Computer. Stellen Sie sicher, dass mindestens 20 isolierte Bilder von fluoreszierenden Kügelchen über das gesamte Sichtfeld vorhanden sind. Speichern Sie die Kalibrierdaten, die später zur Kalibrierung und Extraktion der Punktspreizungsfunktion der linsenlosen Fluoreszenzmikroskopie-Plattform verwendet werden.

Entfernen Sie den mikrofluidischen Chip, der die fluoreszierende Kügelchenprobe enthält, und lösen Sie das Prisma von diesem Chip. Injizieren Sie die zuvor vorbereitete Probe der weißen Blutkörperchen von der Seite der PDMS-Wände in einen anderen unbenutzten Mikrofluidik-Chip. A montieren die Komponenten erneut unter den gleichen Versuchsbedingungen, insbesondere im Hinblick auf die Abstände und die Anregungsleistung.

Erfassen Sie die Rohbilder von weißen Blutkörperchen mit der maßgeschneiderten Laboransicht mit den gleichen Softwareparametern, die für die fluoreszierenden Mikrokügelchen verwendet werden. Die Kalibrierungsdaten und die Rohbilder der weißen Blutkörperchen werden dann verwendet, um durch digitale Verarbeitung Bilder mit höherer Auflösung in MATLAB zu erstellen. Repräsentative Ergebnisse der Weitfeld-Fluoreszenz-On-Chip-Bildgebung eines Gemisches mit vier Mikron und 10 Mikron grün fluoreszierenden Partikeln sind hier zu Vergleichszwecken gezeigt, 10-fach-Mikroskop.

Es werden auch Objektivbilder zur Verfügung gestellt, die gut mit den gezeigten linsenlosen fluoreszierenden Bildern übereinstimmen. Als nächstes ergibt sich eine Weitfeldlinse, weniger fluoreszierende Abbildung einer Mischung, die 10 Mikron grüne und 10 Mikron rote fluoreszierende Partikel enthält. Die linsenlosen Fluoreszenzbilder bieten eine gute Übereinstimmung mit 10-fach-Mikroskopobjektivbildern derselben Proben.

Diese Abbildung zeigt einen Leistungsvergleich der Lucy-Richardson-Dekonvolution und der kompressiven Abtastung auf der Grundlage von Dekodierungsalgorithmen für die Bildgebung verschiedener 10-Mikron-Kügelchenpaare. Die obere Reihe zeigt die objektivlosen rohen Fluoreszenzbilder, in denen Inset-Bilder die mikroskopischen Vergleiche der gleichen Partikel zeigen, die mit einer 10-fach-Objektivlinse erforderlich sind. Die mittlere Reihe zeigt die Ergebnisse der kompressiven Dekodierung, während die untere Reihe die Dekonvolutionsergebnisse von Lucy Richardson zeigt: DDCS und DLR beziehen sich auf die Achsabstände und Mikroskopbilder, CS-dekodierte Linsenbilder und LR de gefaltete Linsen ohne Bilder.

Als nächstes wird die digitale Verarbeitung von Objektiven, weniger fluoreszierenden Rohbildern, veranschaulicht. Ein auf kompressiver Abtastung basierender Algorithmus wird verwendet, um eine räumliche Auflösung von weniger als vier Mikrometern zu erreichen, indem dicht gepackte Perlenpaare mit einem Durchmesser von zwei Mikrometern aufgelöst werden. Die Einschübe zeigen 40-fache Objektivvergleiche, die sehr gut mit den dekodierten Fluoreszenzbildern übereinstimmen.

Dabei bezieht sich D auf die Achsabstände in Mikroskopbildern. Während sich DCS auf die Mittenabstände in der CS-dekodierten Linse bezieht, gibt es weniger fluoreszierende Bilder. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der linsenlosen Bildgebung von fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen.

Die linsenfreien Rohbilder werden schnell mit einem CS-basierten Decoder dekodiert, der sehr gut mit einem herkömmlichen Mikroskopbild derselben Probe übereinstimmt, das mit einer 10-fach-Objektivlinse aufgenommen wurde. Zusätzlich zur Bildgebung können die dekodierten fluoreszierenden Objekte bei Bedarf auch automatisch über eine speziell entwickelte Schnittstelle für On-Chip-Zytometrie-Anwendungen gezählt werden. Hier sehen Sie eine speziell entwickelte, automatisierte Schnittstelle zur Zählung fluoreszierender Objekte in Matlab. Wir haben gerade das Verfahren zur landlosen Fluoreszenzmikroskopie von markierten Zellen und Mikrobeats über ein Sichtfeld von acht Zentimetern im Quadrat demonstriert.

So vergleicht man die Schiffsbildgebungsplattform mit dem dahinter liegenden Schnellkompressionsdecoder. Es wird für Hochdurchsatz-Zytometrie, Micro-Rare-Analysen und Anwendungen in der Realzellforschung recht variabel sein.