Name: Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Erfahren Sie die großmaßstäbliche Expansion von γδ T-Zellen aus peripheren Blutmononukleären Zellen mit Zoledronat und IL-2 für die klinische Krebsimmuntherapie. Diese Methode nutzt zugelassene Wirkstoffe.

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1. Isolierung von PBMC <ol><li> Draw Blut (7,5 bis 8,0 ml) in einen BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin. Die Röhre enthält eine Natrium-Heparin als Antikoagulans und eine Ficoll-Hypaque Dichte Flüssigkeit, plus ein Polyester-Gel-Schranke, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugenröhrchen / Blutprobe bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) in einer horizontalen Rotor (swing-out Kopf) für 20 min bei 1800 x g. Schalten Zentrifuge bremst ab. </li><li> Nach der Zentrifugation erfolgt die Reihenfolge der Schichten wie folgt (gesehen von oben nach unten): a) Plasma - b) periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) roten Blutkörperchen (Abb. 1). </li><li> Sammeln Sie nur einen Bruchteil der Plasmaschicht, so dass 5 bis 10 mm von Plasma oberhalb der Interphase, ohne die Zellschicht. Das Plasma kann für die Kultur (Abschnitt 2.5) verwendet werden. </li><li> Ernte der angereicherten Fraktion (PBMC) in der Interphase mit einer Pipette aufnehmen und in 15 ml konischen Rohr. </li><li> Waschen Sie die PBMC mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), durch Invertieren des Röhrchens 5 mal und dann 5 min bei 400 x g zentrifugieren. </li><li> Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal, und dann Zellpellet in 5 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen. In der Regel 1,3 x10 6 Zellen sind von 1 ml Vollblut gewonnen. </li><li> Bestimmen Sie die Frequenz und Phänotyp der γδ T-Zellen in PBMC mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 3) (Abb. 2). </li></ol> 2. Expansion von γδ T-Zellen <ol><li> Centrifuge Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie die Überstände. </li><li> Bereiten Kulturmedium (CM) durch Zugabe von humanem IL-2 (IL-2) und Zoledronat (Zometa), um Endkonzentrationen von 1000 IU / ml und 5 um beträgt. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) oder OpTmizer (Invitrogen) Medien unterstützen eine gute Erweiterung des γδ T-Zellen (weitere Informationen in den Referenzen 6 und 9). Zometa wird in flüssiger Form (4 mg/5-ml Durchstechflasche) zur Verfügung gestellt. Zur Herstellung eines 5 uM Lösung, mit 50 ul von Zometa um 30 ml Kulturmedium. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Kulturmedium und passen zu 1x10 6 Zellen / ml. </li><li> Pipettieren von 1 ml CM mit 1x10 6 Zellen in jedes Well einer 24-Well-Platte. Für großflächige Kulturen, können die Zellen auf 0,5 x 10 6 Zellen / cm ausgesät werden 2 nach den Flächen der Platte Brunnen, Schüssel oder Flasche. </li><li> Add autologem Plasma (Abschnitt 1.3), gepoolten menschlichen AB sera oder FCS, so dass es etwa 10% des Volumens der Kultur (100 ul pro Well einer 24-Well-Platte) ist. Legen Sie die Platten in einem befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 24-48 Std. </li><li> Pflegen Sie die Kultur mit einer Zelldichte von 0,5-2 x 10 6 Zellen / ml. Fügen Sie frisches Medium mit humanem IL-2 (1000 IU / ml) nur (ohne Zometa) alle 2-3 Tage und Transfer kultivierten Zellen in neue Brunnen oder Flaschen wie nötig, je nach dem Grad der Zellproliferation (Abb. 3). Versorgung Plasma oder Serum, das Medium, so dass die Konzentration im Serum beibehalten werden mindestens 1% betragen. </li><li> Ernten Sie die Zellen am Tag 12-14 und die Frequenz bestimmen, Phänotyp und Funktion der γδ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie (siehe unten). </li></ol> 3. Phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Transfer-200 ul Proben mit 2 x 10 5 Zellen zur Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) Röhren. </li><li> 2 ml kaltem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g. Dann, das Sediment resuspendieren in 50 ul FACS Puffer (PBS + 1% FCS + 0,1% Natriumazid). Add 5 ul jeder Antikörper an die Proben (die monoklonalen Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt). </li><li> Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 20 min. </li><li> 2 ml FACS-Puffer zu jeder Probe und dann Wirbel. Centrifuge Proben für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C. Überstand vorsichtig dekantieren. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 300 ul FACS-Puffer und vortexen. Analysieren Sie die Proben an einem Durchflusszytometer (Abb. 2). </li></ol> 4. IFN-γ Produktion Assay 10 <ol><li> Der Tag vor dem Test, bereiten Stimulatorzellen durch Kultivierung von 3-5 x10 5 Daudi Zellen / ml in RPMI 1640-Medium plus 10% FCS (RPMI-10) über Nacht mit Zometa (5 pM) (im Folgenden bezeichnet Z-Daudi). </li><li> Sammeln Z-Daudi und resuspendieren in RPMI-10 bei 2x10 6 Zellen / ml. 100 l von Z-Daudi (2x10 5) in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. </li><li> Bereiten γδ T-Zellen bei 2x10 6 Zellen / ml in RPMI-10 mit Brefeldin A bei 20 pg / ml. Transfer 100 ul der γδ T-Zell-Suspension (2x10 5) in jede Vertiefung mit Z-Daudi-Zellen oder in Vertiefungen (100 ul RPMI-10 nur oder RPMI-10 mit 20 ng / ml Phorbol 12-myristat 13-Acetat-Steuerung[PMA] plus 2 pg / ml Ionomycin). </li><li> Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 4 h in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C und Resuspendieren der Pellets in 200 ul kaltem PBS. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen. 4 ml kaltem PBS und Zentrifugieren für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 50 ul FACS-Puffer mit FITC-konjugierten Anti-TCRVγ9 (5 ul) und PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 ul). Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt. </li><li> 100 l von IntraPrep Reagenz 1 und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und 100 ul der IntraPrep Reagenz 2. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. </li><li> Add 5 ul PE-konjugierten anti-IFN-γ mAk in das Reagenzglas. Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt. </li><li> 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und Zellpellet in 0,5 ml FACS-Puffer. </li><li> Analysieren Sie die Zellen durch Durchflusszytometer. Gate auf CD3 + TCRVγ9 + Zellen und untersuchen die Expression von IFN-γ (Abb. 4). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Es ist wichtig, den Anteil der γδ T-Zellen in PBMC zu Beginn der Kultur bestimmen. Wie in Abb.. 2 A, der Anteil der CD3 + TCRVγ9 + γδ T-Zellen in PBMC lag bei 1,6% am Tag 0. Die dominierende Populationen wurden CD27 + CD45RA + CD27 + naiven oder CD45RA - zentraler Speicher Phänotypen. Wenn γδ T-Zellen effizient stimuliert wurden, bildeten sie sich zu Clustern an den Tagen 3-5 (Abb. 3 A und B). Als Cluster-Bildung verzögert wurde, das Wachstum von anderen Zelltypen, wie zB CD4 + oder CD8 + αβ T-Zellen oder NK-Zellen das Wachstum von γδ T-Zellen (Abb. 3 C und D) zu dominieren. Nach 14 Tagen der Kultur, nahm die Häufigkeit der γδ T-Zellen um mehr als 93,8% der kultivierten Zellen in erfolgreiche γδ T-Zell-Kulturen (Abb. 2 E). Die kultivierten γδ T-Zellen hochreguliert NKG2D und CD69 Expression (Abb. 2 G und H). Sie zeigten CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp (Abb. 2 F). Die Funktionen der γδ T-Zellen wurden im Hinblick auf die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität untersucht. Die intrazelluläre IFN-γ Färbung zeigte, dass γδ T-Zellen IFN-γ produziert als Reaktion auf PMA / Ionomycin Behandlung oder Z-Daudi-Zellen, die summiert IPP nach Zoledronat-Behandlung (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass Zoledronat effizient stimulieren und zu erweitern funktionale γδ T-Zellen. <table border="1"><tbody><tr><td> Rohr </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> Maus IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> Maus IgG1 </td><td> Maus IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Monoklonale Antikörper in multicolor Färbung von γδ T-Zellen verwendet. Ein Beispiel für die phänotypische Analyse von γδ T-Zellen in unserem Labor durchgeführt ist in Abb.. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Separation von PBMC. Blood (7,5 bis 8,0 ml) wird in eine BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin gezogen und direkt für 20 min bei 1800 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation der resultierenden Schichten von oben nach bo gesehenttom: a) Plasma - b) PBMC und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) Rote Blutkörperchen. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Typische Oberfläche Phänotyp der γδ T-Zellen. PBMC wurden mit Zoledronat und IL-2 für 14 Tage stimuliert. Die Zellen wurden mit FITC-markiertem anti-TCR Vγ9 und PE/Cy5-labeled anti-CD3, um den Ausbau der γδ T-Zellen (A und E) zu überwachen. γδ T-Zellen wurden durch ihre Expression von TCRVγ9 identifiziert und ihre Expression von CD27 und CD45RA (B und F), NKG2D (C und G) oder CD69 (D und H) wurde untersucht. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative γδ T-Zell-Kulturen. PBMC wurden mit IL-2 (1000 IU / ml) und Zoledronat (5 pM) stimuliert. Vertreter Felder angezeigt werden (inverse Mikroskop IX71 [Olympus] x 200). Cluster und Aggregate von γδ T-Zellen können am Tag 3 (A) und Tag 5 (B), wenn γδ T-Zellen wurden erfolgreich ausgebaut beobachtet werden. Im Gegensatz dazu waren keine Cluster oder Aggregate beobachtet werden, wenn γδ T-Zell-Wachstum war nicht ausreichend (C und D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. IFN-γ Produktion. γδ T-Zellen wurden mit RPMI-10 nur (A) oder PMA / Ionomycin (B) oder Z-Daudi (C) für 4 h inkubiert. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von TCRVγ9 gefärbt und dann IFN-γ Produktion wurde durch intrazelluläre IFN-γ Färbung untersucht. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Kinetik der γδ T-Zell-Kultur. (A) Absolute Zahl der kultivierten Zellen, (B) Anteil der γδ T-Zellen und (C) absolute Anzahl der γδ T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
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<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
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<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine effiziente Erweiterung der γδ T-Zellen aus PBMC. γδ T-Zellen aktiviert und durch Zoledronat erweitert und IL-2 entwickeln komplette Effektor-Funktionen, durch die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität wider. Es wurde berichtet, dass die synthetischen phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) und 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP) auch erweitern γδ T-Zellen, jedoch sind sie nicht im Handel erhältlich. Im Gegensatz dazu ist Zoledronat bereits für klinische Anwend...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagent Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> Zoledronat </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> humanem rekombinantem IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium-Heparin </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-Medium </td><td> Cell Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Brefeldin A </td><td> Sigma </td><td> B5936-200 &amp;mgr; l </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> Ionomycin </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-human CD3-FITC oder PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD4-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD8-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD14-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD19-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD45-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD56-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-TCRαβ-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-TCR Vγ9-FITC </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD27-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD45RA-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-NKG2D-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNy-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-ECD oder PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion von humanen peripheren blut γδ t-zellen mit zoledronat

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Menschliche γδ T-Zellen erkennen und reagieren auf eine Vielzahl von Stress-induzierte Antigene, wodurch die Entwicklung angeborenen breiten Anti-Tumor-und anti-infektiösen Aktivität. 1 Die Mehrheit der γδ T-Zellen im peripheren Blut haben die Vγ9Vδ2 T-Zell-Rezeptor. Diese Zellen erkennen Antigen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex-unabhängige Art und Weise und zu entwickeln starke zytolytischer und Th1-like Effektor-Funktionen. 1 Darum sind γδ T-Zellen attraktiven Kandidaten Effektorzellen zur Immuntherapie von Krebs. Vγ9Vδ2 T-Zellen zu phosphoantigens wie reagieren (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), die in Bakterien über Isoprenoidbiosynthese synthetisiert wird; 2 und Isopentenylpyrophosphat (IPP), das hergestellt wird in eukaryotischen Zellen durch die Mevalonatweges. 3 In physiologischer Zustand, ist die Erzeugung von IPP in transformierten Zellen nicht ausreichend für die Aktivierung von γδ T-Zellen. Dysregulation des Mevalonat-Weg in Tumorzellen führt zu einer Akkumulation von IPP und γδ T-Zellen-Aktivierung. 3 Weil Aminobisphosphonate (wie Pamidronat oder Zoledronat) hemmen Farnesylpyrophosphat Synthase (FPP), das Enzym wirkt hinter IPP in der Mevalonat-Weg, intrazellulären IPP und sensitibity auf γδ T-Zellen Anerkennung kann therapeutisch durch Aminobisphosphonate erhöht werden. IPP Akkumulation ist weniger effizient in nontransfomred Zellen als Tumorzellen mit einem pharmakologisch relevante Konzentration von Aminobisphosphonate, die es uns ermöglichen Immuntherapie gegen Krebs durch Aktivierung γδ T-Zellen mit Aminobisphosphonate. 4 Interessanterweise, IPP in Monozyten ansammelt, wenn PBMC mit Aminobisphosphonate behandelt werden, weil der effizienten Drogen-Aufnahme durch die Zellen. 5 Monozyten, die IPP zu akkumulieren Antigen-präsentierenden Zellen und stimulieren Vγ9Vδ2 T-Zellen im peripheren Blut. 6 auf diese Mechanismen, entwickelten wir eine Technik, die für eine groß angelegte Ausbau des γδ T-Zell-Kulturen mit Zoledronat und Interleukin -2 (IL-2). 7 Andere Methoden zur Erweiterung der γδ T-Zellen nutzen die synthetische phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) 8 oder 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP). 9 Alle diese Methoden ex ermöglichen vivo Expansion, die sich in einer großen Anzahl von γδ T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie. Allerdings ist nur Zoledronat eine FDA-Zulassung im Handel erhältlichen Reagenz. Zoledronat-expanded γδ T-Zellen-Display CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp und ihre Funktion kann durch IFN-γ Produktion Assay 7 ausgewertet werden.

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Humane $\gamma\delta$-T-Zellen können eine Vielzahl von stressinduzierten Antigenen erkennen und darauf reagieren und entwickeln dadurch eine angeborene, breit angelegte Anti-Tumor- und ...

Dieses Video zeigt die großtechnische Vermehrung menschlicher Gamma-Delta-T-Zellen aus peripherem Blut unter Verwendung von Zoledronat. Zunächst wird Vollblut einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder P BMCs zu isolieren. Die P BMCs werden mit Zoledronat stimuliert, wodurch Monozyten zu antigenpräsentierenden Zellen werden, und zusätzlich mit IL-2, um die Gamma-Delta-T-Zellen zu aktivieren.Die Zellen werden bis zu 14 Tage lang inkubiert, um Gamma-Delta-T-Zellen zu proliferieren. Die Kulturanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt, dass der Großteil der gewonnenen Zellen ein CD3-positives, Vγ9-positives Phänotyp aufweist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Ate bereits für klinische Anwendungen bei Zometa zugelassen ist.Daher steht ein zuverlässiges Reagenz leicht für die Herstellung von Gamma-Delta-T-Zellen in klinischer Qualität zur Verfügung, wodurch das Verfahren zur Kultur von Makoto Condo- und Amichi Izumi-Zellen demonstriert wird. Techniker aus meinem Labor beginnen dieses Verfahren, indem sie mononukleäre Zellen aus Vollblut isolieren, das in einem BD-Vacutainer-CPT-Röhrchen zur Zellpräparation gesammelt wurde, das Natriumheparin als Antikoagulans sowie eine Flüssigkeit mit hoher Dichte und eine Polyester-Gel-Schranke enthält, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur in einem horizontalen Schwenkkorbrotor 20 Minuten lang bei 1800 × g. Nach der Zentrifugation teilt sich der Inhalt des Röhrchens in fünf Schichten auf.Die oberste gelbe Schicht besteht aus Plasma. Darunter befindet sich eine weißliche Schicht, die periphere mononukleäre Blutzellen und Thrombozyten enthält und auf der helleren gelben Dichtelösung aufliegt. Eine weiße Polyester-Gel-Schicht trennt diese von den körnigen Bestandteilen, die eine grauliche Schicht bilden und auf den roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens aufliegen.Unter Verwendung einer 2-mL-Pipette sorgfältig einen Teil der Plasmaschicht entnehmen, wobei fünf bis 10 mm Plasma oberhalb der Phasengrenze verbleiben, und in ein 15-mL-Konischglas überführen. Das Gefäß bei 4 °C lagern, um es später für die Kultur zu verwenden. Danach mit einer 2-mL-Pipette die PBMC-angereicherte Fraktion an der Phasengrenze gewinnen und in ein 15-mL-Konischglas überführen.Um die PBMCs zu waschen, 10 Milliliter PBS hinzufügen und das Röhrchen fünfmal umdrehen. Anschließend das Röhrchen fünf Minuten bei 400 × g zentrifugieren. Die Waschschritte zweimal wiederholen. Danach, nachdem die Zellen in 5 Milliliter PBS resuspendiert wurden, mit einem Hämozytometer die Zellzahl bestimmen.Typischerweise werden 1,3 × 10⁶ Zellen aus einem Milliliter Vollblut gewonnen. Ein Anteil von PBMCs, der 1 × 10⁶ Zellen enthält, wird abgetrennt und auf Eis gehalten zur Analyse per Durchflusszytometrie.Um die Gamma-Delta-T-Zellen in der PBMC-Probe zu expandieren, die Zellsuspensionen in 15-Milliliter-Konischen Röhrchen fünf Minuten bei 400 × g und Raumtemperatur zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren die Überstände verwerfen und die Zellen in Zellkulturmedium resuspendieren, das mit 1000 IE pro Milliliter IL-2 und fünf Mikromolar Zoledronat bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ergänzt wurde. Zoledronat hemmt die Farnesylpyrophosphat-Synthase in Monozyten, was zur Anreicherung von Isopentenylpyrophosphat und zur Umwandlung der Monozyten in antigenpräsentierende Zellen führt.Nächste Pipette. Ein Milliliter Medium, das eine Million Zellen enthält, in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte geben; die Zellen sollten eine Dichte von 0,5 × 10⁶ pro cm² aufweisen. Bei größeren Kulturen entsprechend auf jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte hochskalieren.Gebe entweder die zuvor gewonnenen 100 Mikroliter autologes Plasma, gepooltes humanes AB-Serum oder FBS hinzu. Stelle die Platten in einen befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Ersetze alle zwei bis drei Tage das Medium durch frisches, serumhaltiges Medium, das 1000 IE pro Milliliter menschliches IL-2 enthält.Wenn die Zellen eine Dichte von 0,5 bis zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter erreichen, teilen Sie sie im Verhältnis 1:2 auf neue Vertiefungen oder Kolben auf. Beobachten Sie die Zellen über mehrere Tage hinweg. Gezeigt sind hier die Zellen am Tag null.Die kleineren Zellen sind Lymphozyten. Die größeren Zellen sind Monozyten. Etwa 24 Stunden später heften sich die Monozyten an den Boden der Vertiefung an. Nach zwei Tagen heften sich einige Lymphozyten an Monozyten an; innerhalb von drei Tagen beginnen sich Gamma-Delta-T-Zellen zu aggregieren. Nach fünf Tagen sind große Zellverbände sichtbar. Im Gegensatz dazu werden keine Cluster oder Aggregate beobachtet, wenn das Wachstum der Gamma-Delta-T-Zellen unzureichend ist. Wenn die Clusterbildung verzögert ist.Wie hier gezeigt, überwiegt das Wachstum anderer Zelltypen wie CD4-positiver oder CD8-positiver αβ-T-Zellen oder NK-Zellen das Wachstum der γδ-T-Zellen. Am Tag 12 bis 14 die Zellen umfassend mit einer 10-Milliliter-Pipette auf- und abpipettieren und die Zellen in 50-Milliliter-Konischgefäße sammeln. Die Zellen können nun mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, um die Häufigkeit, das Phänotyp und die Funktionen der γδ-T-Zellen zu bestimmen.Um eine phänotypische Analyse von PBMCs oder expandierten Gamma-Delta-T-Zellen durchzuführen, überführen Sie zunächst 200&nbsp;Mikroliter Proben, die jeweils zwei mal 10 hoch 5 Zellen enthalten, in neun Röhrchen für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Geben Sie zwei Milliliter kalte PBS-Lösung hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 400&nbsp;×&nbsp;g, anschließend resuspendieren Sie die Zellpellets in 50&nbsp;Mikroliter FACS-Puffer. Fügen Sie fünf Mikroliter jedes benötigten Antikörpers zu den Proben hinzu.Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Nach der Inkubation geben Sie zwei Milliliter Fax-Puffer zu jeder Probe hinzu und wirbeln die Proben anschließend fünf Minuten bei 400 × g und vier Grad Celsius in einer Vortex-Zentrifuge. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren die Zellen in 300 Mikrolitern Fax-Puffer und wirbeln erneut.Dann analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie, um die Funktion von Gamma-Delta-T-Zellen zu bewerten. Ihre Fähigkeit, Interferon gamma zu produzieren, wird durch intrazelluläre Interferon-gamma-Färbung analysiert. Resuspendieren Sie die Gamma-Delta-T-Zellen in einer Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in RPMI 10, das Fötenrinderserum (FCS) mit einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter enthält.Felden A hemmt die Sekretion von Interferon-Gamma, was zur Anreicherung von Interferon-Gamma in der Zelle führt. Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter der Gamma-Delta-T-Zellsuspension in jedes Loch einer 96-Loch-Platte, die jeweils 100 Mikroliter RPMI 10 allein oder RPMI 10 mit 20 Nanogramm pro Milliliter von vier. Ball 12 aß 13 Acetat plus zwei Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin oder Z duddy-Zellen enthält.Mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie vier Stunden lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 400 ×g und 4 °C, nachdem Sie die Pellets in 200 µL kalter PBS resuspendiert haben.Überführen Sie die Proben in Fax-Röhrchen. Geben Sie anschließend vier Milliliter kalte PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 × g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern Fax-Puffer mit fünf Mikrolitern.FE-konjugiertes anti-TCRV-gamma-neun- und 2,5 Mikroliter PE-SCI-fünf-konjugiertes anti-CD-drei-Monoklonalantikörper, 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 100 Mikroliter Intraprep-Reagenz eins hinzufügen und 15 Minuten lang inkubieren. Vier Milliliter PBS zu jedem Röhrchen geben und fünf Minuten bei 400 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Pellet in 100 Mikrolitern Intraprep-Reagenz zwei resuspendieren und fünf Minuten lang inkubieren.Geben Sie bei Raumtemperatur fünf Mikroliter PE-konjugierten anti-Interferon-gamma monoklonalen Antikörper in das Reagenzglas. Inkubieren Sie 15 Minuten lichtgeschützt. Geben Sie bei Raumtemperatur vier Milliliter PBS in jedes Reagenzglas und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 400 × g. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie das Zellpellet.In 0,5 Millilitern Fax-Puffer. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie, indem Sie auf CD3-positive TCR Vγ9-positive Zellen gaten, und untersuchen Sie die Expression von Interferon-γ. Der typische Oberflächenphänotyp von γδ-T-Zellen ist wie hier gezeigt dargestellt.Gammadelta-T-Zellen wurden durch ihre Expression von CD drei und TCRV gamma neun am Tag null identifiziert. Der Anteil von CD-drei-positiven, TCRV-gamma-neun-positiven Gammadelta-T-Zellen in PBMC betrug 1,6 %. Die vorherrschenden Populationen von Gammadelta-T-Zellen wiesen ein CD27-positives, CD45RA-positives naives oder ein CD27-positives, CD45RA-negatives zentrales Gedächtnis-Phänotyp auf. Die Expressionen von CD27 und CD45RA werden zur Bestimmung ihres naiven oder Gedächtnis-Phänotyps verwendet.CD 27 positiv. CD 45. RA positiv ist naiv.CD 27 positiv. CD 45 RA negativ ist zentrales Gedächtnis CD 27 negativ. CD 45.RA-negativ ist Gedächtnis-Effektorzelle. CD27-negativ. CD45.RA-positiv ist ein terminal differenziertes Phänotyp. Der Aktivierungsstatus der Zellen wurde hier gezeigt durch NK-G2D oder CD69 analysiert. Gammadelta-T-Zellen exprimieren NK-G2D, aber nicht CD69.Nach 14 Tagen Kultur stieg die Frequenz der Gamma-Delta-T-Zellen auf mehr als 93,8 % der kultivierten Zellen an. Bei erfolgreichen Gamma-Delta-T-Zell-Kulturen zeigten sie ein CD27-negatives, CD45RA-negatives Effektor-Gedächtnis-Phänotyp. Die kultivierten Gamma-Delta-T-Zellen erhöhten die Expression von NKG2D und CD69.Die intrazelluläre Interferon-gamma-Färbung zeigte, dass Gamma-Delta-T-Zellen Interferon gamma als Reaktion auf die PMA-CIN-Behandlung oder auf Z-Dwy-Zellen, die IPP anreicherten, produzierten. Nach Behandlung mit Zoledronat produzierten 97 % und 19,6 % der Gamma-Delta-T-Zellen Interferon gamma als Reaktion auf die Stimulation mit PMA-CIN bzw. Z-Ddy-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zoledronat funktionelle Gamma-Delta-T-Zellen effizient stimulieren und expandieren kann.Die Kinetik der durch Zoledronat und IL-2 expandierten Gamma-Delta-T-Zellkultur zeigte eine exponentielle Zunahme der absoluten Zahl kultivierter Zellen bis zu 12 bis 14 Tagen. Eine Anreicherung der Gamma-Delta-T-Zellen wurde relativ früh erreicht. Bereits am siebten Tag bestanden fast 80 % der kultivierten Zellen aus Gamma-Delta-T-Zellen. Die absoluten Zahlen der Gamma-Delta-T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten zeigen, dass ungefähr 2,2 × 10⁸ Gamma-Delta-T-Zellen aus 1 × 10⁶ PPMC, die 1,6 × 10⁴ Gamma-Delta-T-Zellen enthielten, nach ihrer Entwicklung gewonnen werden können.Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie den Weg, klinische Anwendungen bei zahlreichen verschiedenen Krebsarten zu erforschen. Diese Kulturmethode wurde in klinischen Studien der Phase eins eingesetzt, um die Sicherheit und Durchführbarkeit der transfundierten, expandierten Gamma-Delta-T-Zell-Therapie bei Patienten mit Krebs zu bewerten.

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Research

Forschung

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