Name: Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Erfahren Sie die großmaßstäbliche Expansion von γδ T-Zellen aus peripheren Blutmononukleären Zellen mit Zoledronat und IL-2 für die klinische Krebsimmuntherapie. Diese Methode nutzt zugelassene Wirkstoffe.

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1. Isolierung von PBMC <ol><li> Draw Blut (7,5 bis 8,0 ml) in einen BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin. Die Röhre enthält eine Natrium-Heparin als Antikoagulans und eine Ficoll-Hypaque Dichte Flüssigkeit, plus ein Polyester-Gel-Schranke, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugenröhrchen / Blutprobe bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) in einer horizontalen Rotor (swing-out Kopf) für 20 min bei 1800 x g. Schalten Zentrifuge bremst ab. </li><li> Nach der Zentrifugation erfolgt die Reihenfolge der Schichten wie folgt (gesehen von oben nach unten): a) Plasma - b) periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) roten Blutkörperchen (Abb. 1). </li><li> Sammeln Sie nur einen Bruchteil der Plasmaschicht, so dass 5 bis 10 mm von Plasma oberhalb der Interphase, ohne die Zellschicht. Das Plasma kann für die Kultur (Abschnitt 2.5) verwendet werden. </li><li> Ernte der angereicherten Fraktion (PBMC) in der Interphase mit einer Pipette aufnehmen und in 15 ml konischen Rohr. </li><li> Waschen Sie die PBMC mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), durch Invertieren des Röhrchens 5 mal und dann 5 min bei 400 x g zentrifugieren. </li><li> Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal, und dann Zellpellet in 5 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen. In der Regel 1,3 x10 6 Zellen sind von 1 ml Vollblut gewonnen. </li><li> Bestimmen Sie die Frequenz und Phänotyp der γδ T-Zellen in PBMC mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 3) (Abb. 2). </li></ol> 2. Expansion von γδ T-Zellen <ol><li> Centrifuge Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie die Überstände. </li><li> Bereiten Kulturmedium (CM) durch Zugabe von humanem IL-2 (IL-2) und Zoledronat (Zometa), um Endkonzentrationen von 1000 IU / ml und 5 um beträgt. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) oder OpTmizer (Invitrogen) Medien unterstützen eine gute Erweiterung des γδ T-Zellen (weitere Informationen in den Referenzen 6 und 9). Zometa wird in flüssiger Form (4 mg/5-ml Durchstechflasche) zur Verfügung gestellt. Zur Herstellung eines 5 uM Lösung, mit 50 ul von Zometa um 30 ml Kulturmedium. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Kulturmedium und passen zu 1x10 6 Zellen / ml. </li><li> Pipettieren von 1 ml CM mit 1x10 6 Zellen in jedes Well einer 24-Well-Platte. Für großflächige Kulturen, können die Zellen auf 0,5 x 10 6 Zellen / cm ausgesät werden 2 nach den Flächen der Platte Brunnen, Schüssel oder Flasche. </li><li> Add autologem Plasma (Abschnitt 1.3), gepoolten menschlichen AB sera oder FCS, so dass es etwa 10% des Volumens der Kultur (100 ul pro Well einer 24-Well-Platte) ist. Legen Sie die Platten in einem befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 24-48 Std. </li><li> Pflegen Sie die Kultur mit einer Zelldichte von 0,5-2 x 10 6 Zellen / ml. Fügen Sie frisches Medium mit humanem IL-2 (1000 IU / ml) nur (ohne Zometa) alle 2-3 Tage und Transfer kultivierten Zellen in neue Brunnen oder Flaschen wie nötig, je nach dem Grad der Zellproliferation (Abb. 3). Versorgung Plasma oder Serum, das Medium, so dass die Konzentration im Serum beibehalten werden mindestens 1% betragen. </li><li> Ernten Sie die Zellen am Tag 12-14 und die Frequenz bestimmen, Phänotyp und Funktion der γδ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie (siehe unten). </li></ol> 3. Phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Transfer-200 ul Proben mit 2 x 10 5 Zellen zur Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) Röhren. </li><li> 2 ml kaltem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g. Dann, das Sediment resuspendieren in 50 ul FACS Puffer (PBS + 1% FCS + 0,1% Natriumazid). Add 5 ul jeder Antikörper an die Proben (die monoklonalen Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt). </li><li> Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 20 min. </li><li> 2 ml FACS-Puffer zu jeder Probe und dann Wirbel. Centrifuge Proben für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C. Überstand vorsichtig dekantieren. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 300 ul FACS-Puffer und vortexen. Analysieren Sie die Proben an einem Durchflusszytometer (Abb. 2). </li></ol> 4. IFN-γ Produktion Assay 10 <ol><li> Der Tag vor dem Test, bereiten Stimulatorzellen durch Kultivierung von 3-5 x10 5 Daudi Zellen / ml in RPMI 1640-Medium plus 10% FCS (RPMI-10) über Nacht mit Zometa (5 pM) (im Folgenden bezeichnet Z-Daudi). </li><li> Sammeln Z-Daudi und resuspendieren in RPMI-10 bei 2x10 6 Zellen / ml. 100 l von Z-Daudi (2x10 5) in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. </li><li> Bereiten γδ T-Zellen bei 2x10 6 Zellen / ml in RPMI-10 mit Brefeldin A bei 20 pg / ml. Transfer 100 ul der γδ T-Zell-Suspension (2x10 5) in jede Vertiefung mit Z-Daudi-Zellen oder in Vertiefungen (100 ul RPMI-10 nur oder RPMI-10 mit 20 ng / ml Phorbol 12-myristat 13-Acetat-Steuerung[PMA] plus 2 pg / ml Ionomycin). </li><li> Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 4 h in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C und Resuspendieren der Pellets in 200 ul kaltem PBS. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen. 4 ml kaltem PBS und Zentrifugieren für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 50 ul FACS-Puffer mit FITC-konjugierten Anti-TCRVγ9 (5 ul) und PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 ul). Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt. </li><li> 100 l von IntraPrep Reagenz 1 und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und 100 ul der IntraPrep Reagenz 2. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. </li><li> Add 5 ul PE-konjugierten anti-IFN-γ mAk in das Reagenzglas. Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt. </li><li> 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und Zellpellet in 0,5 ml FACS-Puffer. </li><li> Analysieren Sie die Zellen durch Durchflusszytometer. Gate auf CD3 + TCRVγ9 + Zellen und untersuchen die Expression von IFN-γ (Abb. 4). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Es ist wichtig, den Anteil der γδ T-Zellen in PBMC zu Beginn der Kultur bestimmen. Wie in Abb.. 2 A, der Anteil der CD3 + TCRVγ9 + γδ T-Zellen in PBMC lag bei 1,6% am Tag 0. Die dominierende Populationen wurden CD27 + CD45RA + CD27 + naiven oder CD45RA - zentraler Speicher Phänotypen. Wenn γδ T-Zellen effizient stimuliert wurden, bildeten sie sich zu Clustern an den Tagen 3-5 (Abb. 3 A und B). Als Cluster-Bildung verzögert wurde, das Wachstum von anderen Zelltypen, wie zB CD4 + oder CD8 + αβ T-Zellen oder NK-Zellen das Wachstum von γδ T-Zellen (Abb. 3 C und D) zu dominieren. Nach 14 Tagen der Kultur, nahm die Häufigkeit der γδ T-Zellen um mehr als 93,8% der kultivierten Zellen in erfolgreiche γδ T-Zell-Kulturen (Abb. 2 E). Die kultivierten γδ T-Zellen hochreguliert NKG2D und CD69 Expression (Abb. 2 G und H). Sie zeigten CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp (Abb. 2 F). Die Funktionen der γδ T-Zellen wurden im Hinblick auf die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität untersucht. Die intrazelluläre IFN-γ Färbung zeigte, dass γδ T-Zellen IFN-γ produziert als Reaktion auf PMA / Ionomycin Behandlung oder Z-Daudi-Zellen, die summiert IPP nach Zoledronat-Behandlung (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass Zoledronat effizient stimulieren und zu erweitern funktionale γδ T-Zellen. <table border="1"><tbody><tr><td> Rohr </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> Maus IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> Maus IgG1 </td><td> Maus IgG1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Monoklonale Antikörper in multicolor Färbung von γδ T-Zellen verwendet. Ein Beispiel für die phänotypische Analyse von γδ T-Zellen in unserem Labor durchgeführt ist in Abb.. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Separation von PBMC. Blood (7,5 bis 8,0 ml) wird in eine BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin gezogen und direkt für 20 min bei 1800 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation der resultierenden Schichten von oben nach bo gesehenttom: a) Plasma - b) PBMC und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) Rote Blutkörperchen. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Typische Oberfläche Phänotyp der γδ T-Zellen. PBMC wurden mit Zoledronat und IL-2 für 14 Tage stimuliert. Die Zellen wurden mit FITC-markiertem anti-TCR Vγ9 und PE/Cy5-labeled anti-CD3, um den Ausbau der γδ T-Zellen (A und E) zu überwachen. γδ T-Zellen wurden durch ihre Expression von TCRVγ9 identifiziert und ihre Expression von CD27 und CD45RA (B und F), NKG2D (C und G) oder CD69 (D und H) wurde untersucht. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative γδ T-Zell-Kulturen. PBMC wurden mit IL-2 (1000 IU / ml) und Zoledronat (5 pM) stimuliert. Vertreter Felder angezeigt werden (inverse Mikroskop IX71 [Olympus] x 200). Cluster und Aggregate von γδ T-Zellen können am Tag 3 (A) und Tag 5 (B), wenn γδ T-Zellen wurden erfolgreich ausgebaut beobachtet werden. Im Gegensatz dazu waren keine Cluster oder Aggregate beobachtet werden, wenn γδ T-Zell-Wachstum war nicht ausreichend (C und D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. IFN-γ Produktion. γδ T-Zellen wurden mit RPMI-10 nur (A) oder PMA / Ionomycin (B) oder Z-Daudi (C) für 4 h inkubiert. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von TCRVγ9 gefärbt und dann IFN-γ Produktion wurde durch intrazelluläre IFN-γ Färbung untersucht. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Kinetik der γδ T-Zell-Kultur. (A) Absolute Zahl der kultivierten Zellen, (B) Anteil der γδ T-Zellen und (C) absolute Anzahl der γδ T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine effiziente Erweiterung der γδ T-Zellen aus PBMC. γδ T-Zellen aktiviert und durch Zoledronat erweitert und IL-2 entwickeln komplette Effektor-Funktionen, durch die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität wider. Es wurde berichtet, dass die synthetischen phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) und 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP) auch erweitern γδ T-Zellen, jedoch sind sie nicht im Handel erhältlich. Im Gegensatz dazu ist Zoledronat bereits für klinische Anwend...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagent Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> Zoledronat </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> humanem rekombinantem IL-2 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium-Heparin </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203-Medium </td><td> Cell Science &amp; Technology Institute </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> Brefeldin A </td><td> Sigma </td><td> B5936-200 &amp;mgr; l </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1MG </td><td></td></tr><tr><td> Ionomycin </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-human CD3-FITC oder PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD4-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD8-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD14-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD19-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD45-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD56-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-TCRαβ-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-TCR Vγ9-FITC </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD27-PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD45RA-ECD </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human-NKG2D-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNy-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-PE </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-ECD oder PE/Cy5 </td><td> Wichtige Produktinformation </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansion von humanen peripheren blut γδ t-zellen mit zoledronat

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Menschliche γδ T-Zellen erkennen und reagieren auf eine Vielzahl von Stress-induzierte Antigene, wodurch die Entwicklung angeborenen breiten Anti-Tumor-und anti-infektiösen Aktivität. 1 Die Mehrheit der γδ T-Zellen im peripheren Blut haben die Vγ9Vδ2 T-Zell-Rezeptor. Diese Zellen erkennen Antigen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex-unabhängige Art und Weise und zu entwickeln starke zytolytischer und Th1-like Effektor-Funktionen. 1 Darum sind γδ T-Zellen attraktiven Kandidaten Effektorzellen zur Immuntherapie von Krebs. Vγ9Vδ2 T-Zellen zu phosphoantigens wie reagieren (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), die in Bakterien über Isoprenoidbiosynthese synthetisiert wird; 2 und Isopentenylpyrophosphat (IPP), das hergestellt wird in eukaryotischen Zellen durch die Mevalonatweges. 3 In physiologischer Zustand, ist die Erzeugung von IPP in transformierten Zellen nicht ausreichend für die Aktivierung von γδ T-Zellen. Dysregulation des Mevalonat-Weg in Tumorzellen führt zu einer Akkumulation von IPP und γδ T-Zellen-Aktivierung. 3 Weil Aminobisphosphonate (wie Pamidronat oder Zoledronat) hemmen Farnesylpyrophosphat Synthase (FPP), das Enzym wirkt hinter IPP in der Mevalonat-Weg, intrazellulären IPP und sensitibity auf γδ T-Zellen Anerkennung kann therapeutisch durch Aminobisphosphonate erhöht werden. IPP Akkumulation ist weniger effizient in nontransfomred Zellen als Tumorzellen mit einem pharmakologisch relevante Konzentration von Aminobisphosphonate, die es uns ermöglichen Immuntherapie gegen Krebs durch Aktivierung γδ T-Zellen mit Aminobisphosphonate. 4 Interessanterweise, IPP in Monozyten ansammelt, wenn PBMC mit Aminobisphosphonate behandelt werden, weil der effizienten Drogen-Aufnahme durch die Zellen. 5 Monozyten, die IPP zu akkumulieren Antigen-präsentierenden Zellen und stimulieren Vγ9Vδ2 T-Zellen im peripheren Blut. 6 auf diese Mechanismen, entwickelten wir eine Technik, die für eine groß angelegte Ausbau des γδ T-Zell-Kulturen mit Zoledronat und Interleukin -2 (IL-2). 7 Andere Methoden zur Erweiterung der γδ T-Zellen nutzen die synthetische phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) 8 oder 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP). 9 Alle diese Methoden ex ermöglichen vivo Expansion, die sich in einer großen Anzahl von γδ T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie. Allerdings ist nur Zoledronat eine FDA-Zulassung im Handel erhältlichen Reagenz. Zoledronat-expanded γδ T-Zellen-Display CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp und ihre Funktion kann durch IFN-γ Produktion Assay 7 ausgewertet werden.

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Humane $\gamma\delta$-T-Zellen können eine Vielzahl von stressinduzierten Antigenen erkennen und darauf reagieren und entwickeln dadurch eine angeborene, breit angelegte Anti-Tumor- und ...

Dieses Video zeigt die großtechnische Vermehrung menschlicher Gamma-Delta-T-Zellen aus peripherem Blut unter Verwendung von Zoledronat. Zunächst wird Vollblut einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen, um mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder P BMCs zu isolieren. Die P BMCs werden mit Zoledronat stimuliert, wodurch Monozyten zu antigenpräsentierenden Zellen werden, und zusätzlich mit IL-2, um die Gamma-Delta-T-Zellen zu aktivieren.Die Zellen werden bis zu 14 Tage lang inkubiert, um Gamma-Delta-T-Zellen zu proliferieren. Die Kulturanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt, dass der Großteil der gewonnenen Zellen ein CD3-positives, Vγ9-positives Phänotyp aufweist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Ate bereits für klinische Anwendungen bei Zometa zugelassen ist.Daher steht ein zuverlässiges Reagenz leicht für die Herstellung von Gamma-Delta-T-Zellen in klinischer Qualität zur Verfügung, wodurch das Verfahren zur Kultur von Makoto Condo- und Amichi Izumi-Zellen demonstriert wird. Techniker aus meinem Labor beginnen dieses Verfahren, indem sie mononukleäre Zellen aus Vollblut isolieren, das in einem BD-Vacutainer-CPT-Röhrc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine in-Vitro menschliche präklinischen Modell des Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten kultiviert mit Brustkrebszelllinien, die Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion zu imitieren. Das Modell könnte verwendet werden, um unser Verständnis der Metastasierung Knochenbildung und Therapiemöglichkeiten zu verbessern.

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Vorgestellt wird ein Protokoll für die Expansion von Gamma-Delta (γδ) T-Zell-Arzneimittel. Lymphozyten werden durch Elutriation isoliert und γδ-angereichert mit Zoledronsäure und Interleukin-2. Alpha-Beta-T-Zellen werden mit einem magnetischen Trenngerät in klinischer Qualität erschöpft. Die γδ-Zellen werden mit K562-abgeleiteten, künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ko-kultiviert und expandiert.

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.

Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Erfahren Sie die großmaßstäbliche Expansion von γδ T-Zellen aus peripheren Blutmononukleären Zellen mit Zoledronat und IL-2 für die klinische Krebsimmuntherapie. Diese Methode nutzt zugelassene Wirkstoffe.

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

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