Hyperinsulinämische-euglykämische Schellen in dem Bewusstsein, Unrestrained Mäuse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die insulinvermittelte Wirkung im gesamten Organismus und in spezifischen Geweben bei wachen, nicht belasteten Mäusen zu bewerten, ohne diese zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem chirurgisch ein Katheter in die Vena jugularis zur Infusion und ein weiterer in die Arteria carotis zur Gewinnung von Blutproben implantiert wird. Nach einer Erholungsphase von fünf bis sieben Tagen werden Mäuse, die fünf Stunden lang nüchtern waren, mit Insulin infundiert, um eine physiologische Hyperinsulinämie zu erzeugen.

Die Glukosespiegel werden anschließend über den arteriellen Katheter gemessen, und die euglykämische Blutglukosekonzentration wird durch Anpassung der Glukoseinfusionsrate aufrechterhalten. Dieses Experiment ermöglicht die Messung von Unterschieden in der insulinvermittelten Ganzkörperempfindlichkeit basierend auf dem direkten Zusammenhang zwischen der zur Aufrechterhaltung der Euglykämie erforderlichen Glukoseinfusionsrate und der Insulinwirkung. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden zur Blutentnahme, wie dem Abschneiden der Schwanzspitze, liegt darin, dass der chirurgisch implantierte arterielle Katheter vaskulären Zugang zum Mausmodell bietet, sodass Blutproben entnommen werden können, ohne das Tier greifen zu müssen.

Dadurch können wir diese Experimente an nicht belasteten und unbewegungseingeschränkten Mäusen durchführen. Der arterielle Katheter wird hergestellt, indem ein abgeschrägtes Stück PE 10-Schlauch in ein sechs Zentimeter langes Stück astischer Schlauchleitung eingeführt wird, sodass das PE 10-Schlauchstück 0,9 Zentimeter über die Spitze hinausragt. Der venöse Katheter ist ein sechs Zentimeter langes Stück SEL-Schlauchleitung mit einer Hülse.

Der Masa wird hergestellt, indem dreizentimeterlange Stücke von PE 20 in jeweils zwei 1,3 Zentimeter lange, 25 Gauge, aus rostfreiem Stahl bestehende Verbinder, Ben, in einem Winkel von etwa 120 Grad eingeführt werden. Diese werden in einen Klecks medizinischen Silikonklebstoffs eingefügt, wie hier gezeigt. Um mit der Katheterimplantation zu beginnen, wird eine anästhesierte Maus unter sterilen Bedingungen auf eine saubere Arbeitsfläche gelegt. Führen Sie einen fünf Millimeter rechts der Mittellinie liegenden Schnitt durch.

Isolieren Sie die rechte Jugularvene. Ligieren Sie die Vena cephalica vorsichtig mit Seidenlitze und legen Sie am kaudalen Ende eine lose Schlinge mit einem weiteren Stück Litze an. Schneiden Sie anschließend direkt unterhalb der Ligatur der Vena cephalica mit einer Feder-Schere und führen Sie den Katheter bis zur Halteperle ein.

Binden Sie eine Naht hinter der Perle und überprüfen Sie die Katheterfunktion, indem Sie das freie Ende des Katheters an eine Abnahmespritze anschließen. Um den arteriellen Katheter zu platzieren, führen Sie einen kleinen Schnitt fünf Millimeter links vom Sternum und kranial zur ersten Inzision durch. Isolieren Sie die linke A. carotis und ligieren Sie dann den kranialen Abschnitt.

Beenden Sie mit einer Seidennaht und knoten Sie sie locker. Ein weiteres Stück Naht am kausalen Ende des exponierten Gefäßes. Danach klemmen Sie das kaudale Ende des Gefäßes ab.

Schneiden Sie direkt unterhalb des ligierten Endes mit einer Feder-Schere. Führen Sie den Katheter vorsichtig bis zur Klemme ein. Lösen Sie die Klemme vorsichtig und schieben Sie den Katheter bis zur Astico-P-Gabelung vor.

Binden Sie die Ligaturen sicher am Katheter fest und überprüfen Sie die Katheterfunktion, indem Sie das freie Ende des Katheters an eine Probenahmespritze anschließen. Drehen Sie das Tier anschließend um und setzen Sie einen kleinen Schnitt zwischen den Schulterblättern an. Führen Sie unter der Haut eine 14-Gauge-Nadel vom vorderen Schnitt bis zu diesem hinteren Schnitt, um einen Tunnel zu bilden. Fädeln Sie den Katheter durch die Nadel, um ihn am Rücken der Maus nach außen zu führen.

Verbinden Sie die arteriellen und venösen Katheter mit den entsprechenden Anschlüssen an der Mausantenne für den Probenentnahmeeingang oder MASA. Danach wird die MASA in den Einschnitt zwischen den Schulterblättern eingeführt. Verschließen Sie beide Einschnitte mit einer Nylonnaht.

Überprüfen Sie die Durchgängigkeit beider Katheter. Stellen Sie die Maus in einen warmen, sauberen Käfig zur Erholung und lassen Sie die Maus mindestens fünf Tage vor dem Insulin-Clamp ausreichend regenerieren. Der schwierigste Schritt bei der Durchführung eines hyperinsulinämischen euglykämischen Clamps bei Mäusen besteht darin, die Euglykämie aufrechtzuerhalten.

Mäuse weisen einen sehr schnellen Stoffwechsel auf, und ihre Glukosespiegel können sich während der Dauer des Experiments erheblich verändern. Erforderlich ist hier etwas Übung, um ein Gefühl dafür zu entwickeln, wie sich die Glukosespiegel einer Maus im Verlauf eines Experiments ändern, und wie anschließend die Glukoseinfusionsrate angepasst werden muss, um eine konstante Glykämie aufrechtzuerhalten. Die Versuchsanordnung für eine Standard-Klammerung ist hier dargestellt.

Drei Infusionslinien für Glukose, Insulin und gewaschene Erythrozyten sind an einen Vier-Wege-Anschluss angeschlossen, der mit einem Drehkupplung verbunden ist und über der Maus angebracht ist. Der Infusionsanschluss der Drehkupplung ist mit dem venösen Katheter verbunden. Vor dem Anschließen der Maus müssen alle Infusionslinien mit Kochsalzlösung gefüllt werden.

Füllen Sie als Nächstes die Probenahmeleitung mit heparinisiertem Kochsalzlösung. Lassen Sie eine Spritze mit heparinisierter Kochsalzlösung am oberen Ende des Drehanschlusses angeschlossen, die zur Spülspritze dient. Beginnen Sie mit dem Fasten der Mäuse fünf bis sechs Stunden vor Beginn des Klemmversuchs.

Drei Stunden nach Beginn der Fastenphase das Mausgewicht bestimmen und die venöse sowie arterielle Katheter entsprechend mit den Infusions- und Probenahmeleitungen verbinden. 15 Minuten vor Beginn des Clamps einen Glukose-Blutabstrich ohne Probe in ein handgehaltenes Glukosemessgerät einführen. Danach etwa 50 Mikroliter Blut in die Spülspritze ziehen, um jegliches Salinum aus der Leitung zu entfernen, und die Spülspritze abnehmen.

Messen Sie den Blutzuckerspiegel, indem Sie den Glukoseteststreifen mit dem Blutstropfen an der Endung der Schlauchleitung in Berührung bringen. Danach führen Sie eine Spritze mit einer stumpfen Nadel in die Probenahmeleitung ein und ziehen 50 Mikroliter Blut ab. Geben Sie das Blut in ein mit EDTA beschichtetes Röhrchen und zentrifugieren Sie es, um das Plasma für die Bestimmung von Basiswerten von Hormonen und Metaboliten zu gewinnen.

Zu diesem Zeitpunkt die Spülkanüle erneut einsetzen und den Kolben hochziehen. Um Luftblasen zu entfernen, die ursprünglich entnommenen 50 Mikroliter Blut erneut infundieren. Den Blutzuckerwert des Glukometers notieren.

10 Minuten später verwenden Sie das Glukometer und die Spülkanüle, um die Blutglukosemessung zu wiederholen, und entnehmen anschließend weitere 50 Mikroliter Blut, um eine weitere Plasmaprobe zu gewinnen. Nachdem die zweiten Basislinienmessungen durchgeführt wurden, füllen Sie die Infusionsleitungen für Glukose, Insulin und physiologische Kochsalzlösung mit gewaschenen Erythrozyten bis zum Vier-Wege-Verbinder auf. Schließen Sie den Vier-Wege-Verbinder an das an die Swivel-Infusionsöffnung angeschlossene Schlauchsystem an.

Beginnen Sie mit der Infusion der salzge­wase­nen Erythrozyten. Stellen Sie die Infusionsge­schwin­dig­keit so ein, dass das gesamte Volumen des während der Studiendauer entnommenen Blutes ersetzt wird. Sobald die Erythrozyteninfusion die Maus erreicht, beginnen Sie mit der Insulin- und Glukoseinfusion.

Dies ist der Zeitpunkt null Minuten. Insulin wird mit einer konstanten, vorab festgelegten Rate zugeführt. Die anfängliche Glukoseinfusionsrate wird anhand der Ausgangswerte der Blutglukosekonzentration und früherer Erfahrungen geschätzt.

Über die nächsten zwei Stunden hinweg nehmen Sie mit dem Glukosemessgerät Blutglukosewerte vor und passen Sie die Glukoseinfusionsrate an, um die Zielglykämie aufrechtzuerhalten. Notieren Sie alle 10 Minuten die neuen Glukosewerte und Glukoseinfusionsraten bei 100 Minuten und 120 Minuten und sammeln Sie zusätzlich Blut zur Bestimmung von Plasma-Insulin sowie weiteren Hormonen oder Metaboliten. Dargestellt ist der zeitliche Verlauf der Glukosespiegel während des Clamp-Verfahrens, der zeigt, wie gut die Glykämie sowohl bei mit Normalkost als auch bei mit fettreicher Kost gefütterten Mäusen während des gesamten Clamps aufrechterhalten wurde. Der zeitliche Verlauf der Glukoseinfusionsrate zeigt, dass die zur Aufrechterhaltung der Glykämie erforderliche Rate in der Gruppe mit fettreicher Kost signifikant niedriger ist, was auf eine Beeinträchtigung der insulinvermittelten Ganzkörperwirkung hindeutet.

Sowohl die nüchternen als auch die clamp-bedingten Insulinspiegel sind in der Gruppe mit fettreicher Ernährung ebenfalls erhöht, was die Existenz eines insulinresistenten Phänotyps weiter untermauert. Bei diesen Mäusen wird tritiiertes Glukose verwendet, um die Rate des endogenen Glukose-Appearances zu schätzen. Endo a ist ein Index der hepatischen Glukoseproduktion, wohingegen Insulin endo A in Kontrollmäusen vollständig unterdrückt.

Die Hemmung ist bei Mäusen, die eine fettreiche Diät erhalten, beeinträchtigt. Ebenso wird TRID-Glukose verwendet, um die Rate des gesamtkörperlichen Glukoseverschwindens zu schätzen. Rd ist die Fähigkeit von Insulin, RD zu stimulieren, bei Mäusen, die eine fettreiche Diät erhalten, beeinträchtigt.

Zwei Deoxyglucose, das Kohlenstoff-14 enthält, wird verwendet, um den Glukosemetabolieindex RG zu bestimmen, ein Maß für die gewebespezifische Glukoseaufnahme. Wie in diesem Beispiel zu sehen ist, ist die insulinstimulierte Glukoseaufnahme in die Skelettmuskulatur bei Mäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert werden, beeinträchtigt. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten mit der Mikrochirurgie, die zur Implantation der arteriellen und venösen Katheter erforderlich ist.

Die Operation erfordert sehr spezialisierte Fähigkeiten, und es bedarf einer konstanten Übung über mehrere Monate, um die Operation für den hyperinsulinämischen euglykämischen Clamp beherrschen zu können; die Schwierigkeit besteht erneut darin, die Euglykämie in einem Tiermodell mit einem sehr hohen Stoffwechsel aufrechtzuerhalten.