Name: Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle chromatographische Methode zur Reinigung hoch aktiver Hefe-Ribosomen mittels cysteinbeladener SFO-Link-Säule. Diese Technik trennt Ribosomen effizient von Nukleasen und Proteasen für biochemische Analysen.

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Wir möchten alle Mitglieder der Dinman Labor, darunter Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, und Michael Rhodin für ihre Hilfe und Input bei diesem Projekt danken. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel unterstützt, von der American Heart Association (AHA 0630163N) AM und von den National Institutes of Health (5R01 GM058859-12) JDD. JAL wurde von einem amerikanischen Reinvestment and Recovery Act of 2009 Ergänzung zu den Eltern zu gewähren (3R01GM058859-11S1) unterstützt.

1. Erstellung eines Cystein berechnet SulfoLink Harz <ol><li> Bereiten SulfoLink Harz (Pierce) bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie insgesamt 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung von SulfoLink Ultraschallgel, wie vom Hersteller in zwei 10 ml Kunststoff-Flaschen geliefert, mit 5 ml in jedes Fläschchen verteilt. </li><li> Kurz Zentrifuge Ampullen bei 850 xg und entfernen Sie vorsichtig Überstände. </li><li> Wash Gel dreimal in Bindungspuffer (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) durch Resuspendieren der Beads in 5 ml, kurze Zentrifugation bei 850 xg und Entfernen des Überstandes mit einer Pipette. </li><li> Fügen Sie fünf ml einer 50 mM Lösung von L-Cystein in Kupplungspuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie die Suspension 1 Stunde bei 25 ° C. </li><li> Entfernen Sie die verbleibenden L-Cystein durch Waschen wie in Schritt 1.4 beschrieben. </li><li> Resuspendieren das Gel in 10 ml Bindungspuffer [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM DTT] und äquilibrieren das Harz durch Waschen in 10 ml Bindungspuffer3-mal, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Dekantieren Harz in einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen Spalte, Kappe und bei 4 ° C. Das Harz Kapazität für RNA-Bindung ~ 20 A 260 Einheiten pro ml. </li></ol> 2. Chromatographische Reinigung von Ribosomen mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz Hinweis: Bei der Arbeit mit einem Stamm, wo Protease-Aktivität erweist sich als ein Problem sein, Proteaseinhibierung Cocktails können in allen nachfolgenden Puffer verwendet werden. <ol><li> Pflegen Sie alle Komponenten auf Eis und bereiten alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser-und Sterilfiltration. </li><li> Wachsen Hefezellen über Nacht zum mittleren Log-Phase (OD 595 = 0,6 bis 1,2) in geeigneten Medien. Pellet-Zellen durch Zentrifugation und Waschen 1 Gramm Zellen in Bindungspuffer und Zentrifuge bei 3700 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 1 ml Bindungspuffer, um eine ungefähre Gesamtvolumen von 2 ml, und stören mit dem gleichen Volumen von 0,5 mm Glasperlen gekühlt auf 4 ° C usingen ein Biospec Mini-Bead Beater (Bartlesville, OK). Die Proben können in mehrere Rohre geteilt werden, wie gebraucht. </li><li> Entfernen Sie aufgebrochene Zellen, Organellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 30.000 xg für 30 Minuten in einer Beckman-Coulter Optima Max E Ultrazentrifuge (Fullerton, CA). </li><li> Unmittelbar vor dem Gebrauch Pellet der Harz für 1 Minute bei 1.000 xg, um die Storage-Lösung zu entfernen. Zwei ml Harz ist für jeden ein Gramm Zellen verwendet. </li><li> Entfernen Zelllysat Überstände von den 30.000 xg Spin (S30), wobei darauf zu Verunreinigungen entweder aus der Lipid-Fraktion an die Spitze oder die Zelltrümmer am Boden der Rohre, und direkt in die Rechnung SulfoLink Gülle zu minimieren. Die Lipidschicht kann entweder durch Beseitigung oder durch Ausstoßen aus der Pipette nach der Spitze in den Überstand überquert hat vermieden werden. </li><li> Inkubieren Sie die S30/Sulfolink Mischung auf Eis ohne Mischen für 15 Minuten. </li><li> Legen Sie die Spalten in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg fürr 1 Minute. </li><li> Setzen Sie den Durchfluss Fraktionen zurück in die Spalten, mischen von Hand, und inkubieren für weitere 15 Minuten auf Eis. </li><li> Legen Sie die Spalten in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg für 1 Minute. Entsorgen Sie den Durchfluss. </li><li> Cap Spalten und 5 ml Bindungspuffer. Mix Spalten von Hand bis resuspendiert, entfernen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie die Spalten Zentrifuge bei 1.000 xg für 1 Minute. Wiederholen Sie diesen Wasch-Protokoll zwei weitere Male. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Elutionspuffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 0,5 mg / ml Heparin), um jede Spalte. Mix Schlämme von Hand, und auf Eis inkubieren für 2 Minuten </li><li> Legen Sie Spalten in neue 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1.000 xg für 1 Minute. Sammeln Eluat. Wiederholen Sie den Elutions noch einmal so, dass die endgültige Kombination Probenvolumina ~ 3 ml sind. Gebrauchte Harz kann mit Elutionspuffer ohne Heparin gewaschen und anschließend durch Äquilibrierung mit verbindlichen buffer, und in 10 ml Volumen Bindungspuffer bei 4 ° C für die Wiederverwendung später gespeichert. </li></ol> 3. Puromycin-Behandlung Hinweis: Eine alternative Methode zur Entfernung kontaminierender tRNA-Spezies ist es, aus einer Glucose reich an Glucose verbraucht Medien Ribosom Abfluss zu fördern wechseln. Allerdings ändert das die metabolischen Status der Hefezellen, die Ribosomen-Funktion und Konzentration beeinträchtigen könnten. Um die Ribosomen aus endogenen Peptidyl-tRNA, eine Behandlung mit Puromycin durchgeführt Streifen. <ol><li> Neutralisieren auf pH 7,5 100 mM Puromycin Lösung durch Zugabe von 1M KOH tropfenweise bei Raumtemperatur. </li><li> Add neutralisiert Puromycin Lösung ~ 1mm Endkonzentration im Eluat. </li><li> Add 100 mM GTP zu einer Endkonzentration von 1 mM. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten bei 30 ° C. </li></ol> 4. Reinigung von Ribosomen durch Sedimentation durch Glycerin Kissen <ol><li> Legen Sie eine mlvon Polster-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 25% Glycerin) in ein 4 ml Volumen Polycarbonat Ultrazentrifuge Röhre. </li><li> Vorsichtig Schicht Puromycin Elutionsfraktionen auf der Oberseite des Kissens und Zentrifuge Proben bei 100.000 xg bei 4 ° C über Nacht behandelt </li><li> Nehmen Sie Rohre aus dem Zentrifugenrotor, und saugen Überstände. </li><li> Wash Pellets gereinigt Ribosomen zweimal mit 1 ml der Kissen-Puffer. </li><li> Resuspendieren Ribosomen in 100 ul Kissen Puffer durch vorsichtiges Störung mit einem Glasstab. </li><li> Nach Unterbrechungen, decken Rohre mit Parafilm und schütteln mit mäßiger Geschwindigkeit in einem kalten Raum Wirbel für eine Stunde. </li><li> Übertragen Sie den Inhalt in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifuge für 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 ° C, und entfernen Sie Überstände an die frische Röhren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 4,1 bis 4,7 mit 2 ml Puffer und Polster, außer dass 100 ul der Pufferspeicher (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, 25% Glycerin) in Schritten 4.4 und 4.5 statt Kissen Puffer verwendet. </li><li> Quantifizierung der gereinigten Ribosomen spektrophotometrisch (1 A 260 = 20 pMol Hefe Ribosomen) und bei -80 ° C. Typische Ergebnisse von 1 Gramm Hefe sind 300-400 pmol Ribosomen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für RNA-Spezies aus jedem der drei großen Schritte des Protokolls extrahiert wird in Abbildung 2 dargestellt. Während rRNAs sind die wichtigsten Arten, die in insgesamt Zelllysaten (T) enthält auch diese eine große Anzahl von anderen RNA-Spezies. Ribosomen aus dem SulfoLink Spalte (SL) gereinigt enthalten auch eine große Menge von tRNAs durch die hohe Affinität der Spalte Bett für diese Arten auch. Die Behandlung dieser Fraktion mit Puromycin führt zur Hydrolyse von Peptiden aus Peptidyl-tRNAs und fördert Dissoziation dieser Arten aus Ribosomen. Die Puromycin behandelten Proben (Pm) mangelnde Zusammenarbeit purifying tRNA-Spezies, und stellen damit vollkommen rein Ribosomen. Wie bereits 8 berichtet, sind diese Ribosomen sehr intakt und biochemisch aktiver, wodurch sie ideal Substrate für detaillierte funktionelle und strukturelle Analysen. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Methode Flowchart. Chromatographische Reinigung von Ribosomen mit dem Cystein verknüpft SulfoLink Harz dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Vertreter Analyse von Ribosomen Zubereitungen. Gesamt-RNA Spezies wurden aus insgesamt Zelllysaten (T), SulfoLink gereinigt Ribosomen (SL) und SulfoLink gereinigt Ribosomen anschließend mit Puromycin behandelt extrahiert und sedimentiert durch eine Glycerin Kissen (PM). Lane M steht für RNA-Größenmarker. Bands vertreten 25S-und 18S-rRNA, sowie tRNAs und anderen RNA-Spezies sind angegeben. AlleBahnen wurden mit 2 pg RNA geladen.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
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<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
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<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ribosomen Aufreinigungsprotokolle grundsätzlich um Zellen zu lysieren, die Ernte einer cytosolischen Fraktion aus einer niedrigen Geschwindigkeit drehen, und dann Pelletierung Ribosomen durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation 1. Während ein paar neue Methoden zur Reinigung von bakteriellen Ribosomen verwendet wurden, hatte das gleiche nicht für Eukaryoten 2-4 wahr. Obwohl zusätzliche Schritte im Laufe der Jahre, wie zB Salz wäscht, und Glycerin Kissen (siehe zB 5) hinzugefügt worden sin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> SulfoLink Coupling Harz </td><td> Durchstechen </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini Bead-Beater 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E Ultrazentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Legend RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Glasperlen </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

chromatographische reinigung von hoch aktiven hefe ribosomen

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotischen Ribosomen sind sehr viel labiler als ihre eubakterielle und archael Pendants verglichen, so dass damit eine bedeutende Herausforderung für die Forscher. Besonders störend ist die Tatsache, dass die Lyse von Zellen eine große Anzahl von Proteasen und Nukleasen, die Ribosomen abbauen können Releases. Daher ist es wichtig, dass Ribosomen aus dieser Enzyme so schnell wie möglich zu trennen. Leider lässt herkömmlicher Differenzialsperren Ultrazentrifugation Methoden Ribosomen, die mit diesen Enzymen für unvertretbar lange Zeiträume, die Einfluss auf die strukturelle Integrität und Funktionalität. Um dieses Problem anzugehen, setzen wir ein chromatographisches Verfahren mit einem Cystein berechnet SulfoLink Harz. Diese einfache und schnelle Anwendung deutlich reduziert Co-Reinigung proteolytische und nucleolytischen Aktivitäten, hohe Erträge von intakten, sehr biochemisch aktive Hefe Ribosomen. Wir schlagen vor, dass diese Methode auch anwendbar sein Säugetier-Ribosomen. Die Einfachheit derdie Methode und die verstärkte Reinheit und Aktivität der chromatographisch gereinigten Ribosomen stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt für das Studium der eukaryotischen Ribosomen.

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eukaryotische Ribosomen sind wesentlich labiler als ihre eubakteriellen und archäellen Gegenstücke, was Forscher vor erhebliche Herausforderungen stellt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intakte, hochaktive Hefe-Ribosomen zu reinigen. Dazu wird zunächst eine Zelllyse durchgeführt und das Lysat durch Zentrifugation mit hoher Geschwindigkeit geklärt. Zur Gewinnung der S 30-Deffraktion wird anschließend eine mit Cystein beladene SFO-Link-Säule verwendet, um die Ribosomen zu reinigen.Anschließend erfolgt die Entfernung kontaminierender tRNAs durch eine Behandlung mit Puromycin als letzter Reinigungsschritt. Die Ribosomen werden einer Ultrazentrifugation mit hoher Geschwindigkeit unterzogen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Reinigung durch Ultrazentrifugation besteht darin, dass die Verwendung der Sulfa-Link-Säule Ribosomen rasch von kontaminierenden Exonukleasen und Proteasen trennt.Außerdem trennt der Puromycin-Behandlungsschritt Ribosomen von kontaminierenden RNA-Arten wie tRNAs. Diese Schritte gewährleisten die Herstellung großer Mengen hochaktiver, intakter gereinigter Ribosomen für biochemische und strukturelle Untersuchungen. Den Ablauf demonstriert Jonathan Leschen, ein Postdoktorand aus meinem Labor.Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine 50 %ige Slurry-Lösung des vom Hersteller bereitgestellten Sulfa-Link-Kupplungsgeles in zwei 10-Milliliter-Kunststoffgefäße pipettieren, wobei jeweils fünf Milliliter in jedes Gefäß gegeben werden. Nach einer kurzen Zentrifugation der Gefäße bei 850 × g entfernen Sie vorsichtig die Überstände. Waschen Sie das Gel dreimal mit Kopplungspuffer, indem Sie die Kügelchen jeweils in fünf Milliliter Puffer resuspendieren und anschließend kurz bei 850 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit der Pipette. Nach dem Waschen des Harzes geben Sie jeweils fünf Milliliter einer 50 Millimolar-Lösung von L-Cystein im Kopplungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu.Rühren Sie die Suspension eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie dann das restliche L-Cystein, indem Sie das Harz dreimal ausschütteln mit Kopplungspuffer allein. Anschließend resuspendieren Sie das Gel in 10 Milliliter Bindungspuffer und equilibrieren Sie das Harz durch dreimaliges Waschen.Schließlich gießen Sie das Harz in eine 10-Milliliter-Zentrifugensäule und verschließen Sie diese. Das Harz kann bei vier Grad Celsius gelagert werden und hat eine Harzkapazität von etwa 20 zwei 60 Einheiten pro Milliliter während der chromatographischen Reinigung von Ribosomen. Unter Verwendung eines mit Cystin beladenen Sulfalinker-Harzes.Halten Sie alle Komponenten auf Eis und bereiten Sie alle Lösungen mit RNA-freiem Wasser und steriler Filtration vor. Kultivieren Sie Hefezellen über Nacht bis zur mittleren log-Phase in dem entsprechenden Medium. Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation pelletiert haben, waschen Sie ein Gramm Zellen in Bindungspuffer und zentrifugieren erneut, anschließend resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Bindungspuffer auf ein ungefähres Gesamtvolumen von zwei Millilitern.Zerstören Sie die Zellen unter Verwendung eines gleichen Volumens an 0,5 Millimeter großen Glasperlen, die auf vier Grad Celsius gekühlt wurden, sowie eines Mini-Bead-Beaters. Entfernen Sie unversehrte Zellen, Organellen und zellulären Abfall durch Zentrifugation bei 30.000 × g für 30 Minuten in einem Ultrazentrifugator. In der Zwischenzeit pelletieren Sie die Harzmatrix für eine Minute bei 1.000 × g, um die Lagerungslösung unmittelbar vor der Verwendung zu entfernen.Für jedes Gramm Zellen werden zwei Milliliter Harz verwendet. Nach der Ultrazentrifugation der Proben entfernen Sie die Überstände des Zelllysats aus dem 30.000-mal-G-Spin, bezeichnet als S 30. Achten Sie darauf, Kontaminationen durch die Lipidfraktion an der Oberfläche oder durch Zelltrümmer am Boden der Röhrchen so gering wie möglich zu halten.Überführen Sie die Überstände direkt in die beladene SFO-Link-Suspension. Inkubieren Sie das S 30 SFO-Link-Gemisch 15 Minuten lang auf Eis. Stellen Sie die Säulen in 50-Milliliter-Konischgefäße und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 × g. Überführen Sie die Durchlauf-Fraktionen erneut in die Säulen, verschließen Sie die Säulen und invertieren Sie sie zum Mischen.Inkubieren Sie die Proben weitere 15 Minuten auf Eis. Danach setzen Sie die Säulen in 50-Milliliter-Konischgefäße und zentrifugieren bei 1000 × g für eine Minute; verwerfen Sie den Durchlauf. Nach Zugabe von fünf Milliliter Bindungspuffer verschließen Sie die Säulen und invertieren sie zum Mischen, bis die Probe resuspendiert ist.Entfernen Sie die Deckel und zentrifugieren Sie die Säulen bei 1000 ×g für eine Minute. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll insgesamt zwei weitere Male. Fügen Sie danach 1,5 Milliliter Elutionspuffer zu jeder Säule hinzu.Mischen Sie die Suspensionen von Hand und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang auf Eis. Als letzter Schritt bringen Sie die Säulen in neue 50-Milliliter-Konischgefäße und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1000 × g. Sammeln Sie das Eluat und wiederholen Sie den Elutionsschritt noch einmal, sodass die endgültigen kombinierten Probenvolumina etwa drei Milliliter betragen. Um die Ribosomen vom endogenen Peptidyl-tRNA zu lösen, wird eine Behandlung mit Puromycin durchgeführt.Zunächst neutralisieren Sie eine 100 mmolare Pur­mycin-Lösung durch Zugabe von einmolarer Kaliumhydroxid tropfenweise auf pH 7,5. Geben Sie Raumtemperatur hinzu. Fügen Sie die neutralisierte Pur­mycin-Lösung in einer Endkonzentration von etwa einem Millimolar in das Eluat ein.Dann GTP auf eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen. Die Mischung 30 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation ein Milliliter Polsterpuffer in ein vier Milliliter fassendes Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen geben.Überlagern Sie vorsichtig die mit Puromycin behandelten Elutionsfraktionen auf dem Pufferpolster und zentrifugieren Sie die Proben über Nacht bei 100.000 × g. Nach dem Absaugen der Überstände waschen Sie die Pellets, die die gereinigten Ribosomen enthalten, mit einem Milliliter Polsterpuffer. Wiederholen Sie diese Waschung mit einem weiteren Milliliter Polsterpuffer.Dann löste Reza die Ribosomen in 100 Mikroliter Puffer mit Polsterlösung durch vorsichtige Zerstörung mit einem Glasstab auf. Danach deckten die Röhrchen mit Parafilm ab und schüttelten sie mit mäßiger Geschwindigkeit in einem Kaltraum-Wirbel. Nach einer Stunde Schütteln überführte man den Inhalt in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugierte fünf Minuten bei maximaler Drehzahl bei vier Grad Celsius.Überführen Sie die Überstände in frische Röhrchen. Schichten Sie die Überstände auf zwei Milliliter Polsterpuffer in einem Ultrazentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100.000 × g über Nacht. Am nächsten Tag nehmen Sie die Röhrchen aus dem Zentrifugenrotor und aspirieren die Überstände.Mit der soeben beschriebenen Methode die Pellets waschen und die Ribosomen mit Lagertuffer resuspendieren. Abschließend die gereinigten Ribosomen spektralphotometrisch quantifizieren, bevor sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Hier ist ein Beispiel für RNA-Arten dargestellt, die aus jedem der drei Haupt­schritte des Protokolls gewonnen wurden, einschließlich der gesamten Zelllysate, der sulf olink-purifizierten Ribosomen und der sufu link-purifizierten Ribosomen, die anschließend mit Purmycin behandelt und durch ein Glycerinpolster zentrifugiert wurden. Es werden außerdem RNA-Größenmarker gezeigt, während unsere RNAs die vorherrschenden Arten in den gesamten Zelllysaten darstellen. Diese enthalten zudem eine große Anzahl weiterer RNA-Arten.Aus der Sulfa-Link-Säule gereinigte Ribosomen enthalten aufgrund der hohen Affinität der Säulenschüttung für diese Spezies eine große Menge an tRNAs. Die Behandlung dieser Fraktion mit Piro Mycin führt zur Hydrolyse von Peptiden aus Peptol-tRNAs und fördert die Dissoziation dieser Spezies von Ribosomen. Die mit Pure Mycin behandelten Proben weisen keine mitgereinigten tRNA-Spezies auf und stellen somit vollständig reine Ribosomen dar.Wie zuvor berichtet, sind diese Ribosomen hochgradig intakt und biochemisch aktiv, was sie zu idealen Substraten für detaillierte funktionelle und strukturelle Analysen macht. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Assays zur Überwachung der Bindung von Liganden an Ribosomen sowie strukturelle Analysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Welche biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften besitzen eukaryotische Ribosomen?

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Wir beschreiben eine schnelle und effektive Methode zur Aufreinigung von Mitochondrien aus der...

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Quelle: Becker, B., et al. Ein einfacher, fluoreszenzbasierter Reporter-Assay zur Identifizierung zellulärer Bestandteile, die für den Transport von Ricintoxin A-Kette (RTA) in Hefe benötigt werden. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Reinigung eines polyhistidin-markierten rekombinanten Proteins mittels nickelbasierter Affinitätschromatographie. Es beschreibt wichtige Schritte, darunter bakterielle Lyse durch Sonikation, Klärung und Filtration des Lysats sowie selektive Bindung...

 Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Hier stellen wir einen Workflow für die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR Heterodimeren in Hefe vor.

Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

Wir präsentieren eine schnelle und kostengünstige Methode zur Herstellung des rekombinanten PURE zellfreien TX-TL-Systems mit Standard-Laborgeräten.

OnePot PURE Zellfreies System

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Dieses Protokoll stellt eine Locus-spezifische Chromatin-Isolierungsmethode vor, die auf ortsspezifischer Rekombination basiert, um einen interessierenden Single-Copy-Genlocus in seinem nativen Chromatinkontext aus knospender Hefe, Saccharomyces cerevisiae, zu reinigen.

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

Erfahren Sie eine schnelle chromatographische Methode zur Reinigung hoch aktiver Hefe-Ribosomen mittels cysteinbeladener SFO-Link-Säule. Diese Technik trennt Ribosomen effizient von Nukleasen und Proteasen für biochemische Analysen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

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