Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Reinigung intakter, hochaktiver Hefe-Ribosomen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen lysiert und das Lysat durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation geklärt wird. Um die S 30-Defraktion zu erhalten, wird dann eine mit Cystein geladene SFO-Link-Säule verwendet, um die Ribosomen zu reinigen.

Es folgt die Entfernung kontaminierender tRNAs mit einer Pur-Mycin-Behandlung als abschließender Reinigungsschritt. Die Ribosomen werden einer Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrierung unterzogen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ultrazentrierungsreinigung besteht darin, dass die Verwendung der Sulfa-Link-Säule Ribosomen schnell von kontaminierenden Exonukleasen und Proteasen trennt.

Darüber hinaus trennt der Pur-Mycin-Behandlungsschritt Ribosomen von kontaminierenden RNA-Spezies wie tRNAs. Diese Schritte gewährleisten die Produktion großer Ausbeuten an hochaktiven, intakten gereinigten Ribosomen für den Einsatz in biochemischen und strukturellen Studien. Das Verfahren wird von Jonathan Leschen, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine 50%ige Aufschlämmung des vom Hersteller gelieferten Sulfa-Link-Kupplungsgels in zwei 10-Milliliter-Kunststofffläschchen pipettieren, wobei fünf Milliliter in jedes Fläschchen verteilt werden. Nach kurzem Zentrifugieren der Fläschchen bei 850 mal G.Entfernen Sie vorsichtig die Überstände. Waschen Sie das Gel dreimal in Kupplungspuffer durch Reanimation, suspendieren Sie die Kügelchen in fünf Millilitern und zentrifugieren Sie dann kurz bei 850 mal G. Entfernen Sie den Überstand mit der Pipette Nach dem Waschen des Harzes geben Sie fünf Milliliter einer 50 millimolaren Lösung von L-Cystein in Kupplungspuffer in jedes Röhrchen.

Mischen Sie die Gülle eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie dann das restliche L-Cystein, indem Sie das Harz dreimal nur mit Kupplungspuffer waschen. Als nächstes resuspendieren Sie das Gel in 10 Millilitern Bindepuffer und äquilibrieren das Harz durch dreimaliges Waschen.

Zum Schluss wird das Harz in eine 10-Milliliter-Zentrifugensäule umgefüllt und verschlossen. Das Harz kann bei vier Grad Celsius gelagert werden und hat eine Harzkapazität von etwa 20 bis 60 Einheiten pro Milliliter während der chromatographischen Reinigung von Ribosomen. Unter Verwendung eines mit Cystin geladenen Sulfa-Link-Harzes.

Bewahren Sie alle Komponenten auf Eis auf und bereiten Sie alle Lösungen mit RNAs, freiem Wasser und Sterilfiltration vor. Hefezellen über Nacht bis zur mittleren logarithmischen Phase in den entsprechenden Medien züchten. Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation geblassen haben, waschen Sie ein Gramm Zellen in Bindungspuffer und zentrifugieren Sie erneut, dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Bindungspuffer auf ein ungefähres Gesamtvolumen von zwei Millilitern.

Brechen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen von 0,5 Millimeter großen Glasperlen, die auf vier Grad Celsius gekühlt werden, sowie einem Mini-Perlenbeader auf. Entfernen Sie ununterbrochene Zellen, Organellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 30.000 mal, G für 30 Minuten in einer Ultrazentrifuge. In der Zwischenzeit das Harz eine Minute lang 1000-mal pelletieren G.To die Aufbewahrungslösung unmittelbar vor Gebrauch entfernen.

Für jedes Gramm Zellen werden zwei Milliliter Harz verwendet. Nach der Ultrazentrifugation der Proben entfernen Sie die Zelllysatüberstände aus dem 30.000-fachen G-Spin, der als S 30 bezeichnet wird. Achten Sie darauf, die Kontamination durch die Lipidfraktion ganz oben oder die Zelltrümmer am Boden der Röhrchen zu minimieren.

Überführen Sie die Überstände direkt in den geladenen SFO-Link-Slurry. Das S 30 SFO Link-Gemisch 15 Minuten auf Eis inkubieren. Legen Sie die Säulen in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 1000 mal G, übertragen Sie den Durchfluss durch die Fraktionen zurück in die Säulen, verschließen Sie die Säulen und drehen Sie sie um, um sie zu mischen.

Inkubieren Sie die Proben für weitere 15 Minuten auf Eis. Legen Sie dann die Säulen in konische 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1000 mal G Eine Minute lang den Durchfluss durch. Nachdem Sie fünf Milliliter Bindungspuffer hinzugefügt haben, verschließen Sie die Säulen und invertieren Sie sie, um sie zu mischen, bis sie wieder suspendiert sind.

Entfernen Sie die Verschlüsse und zentrifugieren Sie die Säulen eine Minute lang bei 1000 mal G. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll und weitere zwei Mal. Fügen Sie als Nächstes 1,5 Milliliter Elutionspuffer zu jeder Spalte hinzu.

Die Schlämme von Hand mischen und zwei Minuten auf Eis inkubieren. Als letzten Schritt werden die Säulen in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen gesetzt und bei 1000 mal G zentrifugiert. Eine Minute lang wird das Eluat aufgefangen und der elucianische Schritt noch einmal wiederholt, so dass das endgültige kombinierte Probenvolumen etwa drei Milliliter beträgt. Um die Ribosomen von endogenem Peptol zu befreien, wird eine T-R-N-A-A-Behandlung mit purem Mycin durchgeführt.

Neutralisieren Sie zunächst eine 100 Millimolare reine Mycinlösung auf pH 7,5, indem Sie ein molares Kaliumhydroxid tropfenweise hinzufügen. Fügen Sie Raumtemperatur hinzu. Die neutralisierte reine Mycinlösung wird bis zu einer Endkonzentration von etwa einem Millimolar im Eluat zugegeben.

Geben Sie dann 100 Millimolar GTP bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach der Inkubation geben Sie einen Milliliter Kissenpuffer in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Volumen von vier Millilitern.

Schichten Sie die mit Purmycin behandelten Elutionsfraktionen vorsichtig auf das Kissen und zentrifugieren Sie die Proben über Nacht bei 100.000 G G. Nach dem Aspirieren der Überstände wird das Granulat mit den gereinigten Ribosomen mit einem Milliliter Polsterpuffer gewaschen. Wiederholen Sie diese Wäsche mit einem zweiten Milliliter Polsterpuffer

Dann gab Reza die Ribosomen in 100 Mikrolitern Polsterpuffer durch sanftes Aufbrechen mit einem Glasstab aus. Decken Sie anschließend die Röhrchen mit Param ab und schütteln Sie sie bei mäßiger Geschwindigkeit in einem kalten Raumwirbel. Nach einer Stunde Schütteln wird der Inhalt für fünf Minuten bei maximaler Geschwindigkeit von vier Grad Celsius in eine Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge überführt.

Übertragen Sie die Überstände in frische Röhrchen. Schichten Sie die Überstände auf zwei Milliliter Kissenpuffer in einem Ultrazentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100.000 G.Overnight. Am nächsten Tag die Röhrchen vom Zentrifugenrotor entfernen und die Überstände ansaugen.

Mit der soeben beschriebenen Methode. Waschen Sie die Pellets und resuspendieren Sie die Ribosomen mit Lagerpuffer. Schließlich quantifizieren Sie die gereinigten Ribosomenspektren photometrisch, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Hier ist ein Beispiel für RNA-Spezies gezeigt, die aus jedem der drei Hauptschritte des Protokolls extrahiert wurden, einschließlich der Gesamtzelllysate, des Sulfolinks, der gereinigten Ribosomen und der gereinigten Ribosomen der Sufu-Verbindung, die anschließend mit reinem Mycin behandelt und durch ein Glycerinkissen sedimentiert wurden. RNA-Größenmarker sind ebenfalls dargestellt, während unsere RNAs die Hauptspezies sind, die in den Gesamtzelllysaten vorhanden sind. Diese enthalten auch eine große Anzahl anderer RNA-Spezies.

Ribosomen, die aus der Sulfa-Link-Säule gereinigt werden, enthalten aufgrund der hohen Affinität des Säulenbetts zu diesen Spezies eine große Menge an tRNAs. Die Behandlung dieser Fraktion mit Piromycin führt zu einer Hydrolyse von Peptiden aus Peptol-tRNAs und fördert die Dissoziation dieser Spezies von Ribosomen. Den reinen Mycin-behandelten Proben fehlen co-reinigende TRNA-Spezies und stellen daher vollständig reine Ribosomen dar.

Wie bereits berichtet, sind diese Ribosomen hochgradig intakt und biochemisch aktiv, was sie zu idealen Substraten für detaillierte funktionelle und strukturelle Analysen macht. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Assays zur Überwachung der Bindung von Liganden an Ribosomen und Strukturanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften eukaryotische Ribosomen haben.